ATP生物發(fā)光技術(shù)的發(fā)展與應用

ATP是化學(xué)物質(zhì)三磷酸腺苷的簡(jiǎn)稱(chēng)，存在于所有的生物體中(從微生物到高等動(dòng)物)，ATP在細胞體內主要作用是提供能量。鑒于A(yíng)TP存在于所有生物體中，利用ATP發(fā)光檢測儀檢測ATP，可以間接地證明生物體的存在。隨著(zhù)食品行業(yè)對食品衛生質(zhì)量要求越來(lái)越高，而且ATP生物發(fā)光法在檢測食品微生物時(shí)簡(jiǎn)單、快速且靈敏度高，因此近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。水分測定儀| 濁度計| 色度計| 粘度計| 折射計| 滴定儀| 密度計| 熱流計| 濃度計| 折射儀| 采樣儀|  
1 ATP生物發(fā)光技術(shù)的發(fā)展過(guò)程
    ATP生物發(fā)光技術(shù)產(chǎn)生于20世紀70年代中期。1983年，Moyer[1]等最早提出細胞內源性ATP的含量可以反映細胞的活性和活細胞的數量。同年Gronroos[2]等也證實(shí)該技術(shù)是一種可靠、靈敏度高的確定細胞活性度的檢測方法。20世紀80年代，英國人首先研制出ATP檢測儀檢測系統，隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本。應用范圍涉及食品加工、超市和飲食行業(yè)，檢測內容包括微生物和食品殘渣。1998年，日本國會(huì )頒布了《關(guān)于食品制造過(guò)程管理高度化臨時(shí)措施法》，其中即包含了應用ATP檢測儀檢測系統的內容。1999年，日本還成立了ATP涂抹檢查研究會(huì )，專(zhuān)門(mén)研究該方法的使用效率和應用領(lǐng)域，其內容之一就是在食品衛生監測領(lǐng)域中，解決現場(chǎng)微生物的檢測問(wèn)題。20世紀末，一些ATP檢測儀檢測系統及技術(shù)被引進(jìn)我國，到目前為止，除個(gè)別省級衛生監督檢測單位裝備外，主要是在一些外資或合資企業(yè)中自行檢測使用。2002年，我國衛生部頒發(fā)了食品加工企業(yè)HACCP實(shí)施指南，鼓勵食品加工企業(yè)引入ATP檢測系統。近年來(lái)，蟲(chóng)熒光素酶已通過(guò)基因工程生產(chǎn)，價(jià)格大幅度降低，隨著(zhù)相關(guān)儀器的小型化，ATP生物發(fā)光技術(shù)必將會(huì )在國內相關(guān)行業(yè)得到迅速普及[3] 。 
2  ATP生物發(fā)光法菌落計數與傳統方法的比較 
2.1  ATP生物發(fā)光法菌落計數 
   ATP廣泛存在于各種活的生物體中，活的菌體中也含有ATP。細菌死亡后，在細胞內酶的作用下，將很快被分解掉。ATP生物熒光檢測是基于生物發(fā)光體系的發(fā)光機理所設計，螢火蟲(chóng)具有特殊的發(fā)光物質(zhì)--蟲(chóng)熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結合，熒光素分子中的電子躍遷到高能級，處于不穩定的激發(fā)態(tài)，當電子跳回到低能級時(shí)，即發(fā)出熒光光子。該光的強度與被檢測物質(zhì)中所含的ATP量成正比，利用高靈敏度的儀器測定光的強度進(jìn)行定量分析。因此，通過(guò)測定樣品中ATP的濃度，即可推算出活菌數。生物發(fā)光法的檢測步驟大體包括：棉拭取樣、樣品萃取、添加熒光素和熒光素酶混合物、測定生物發(fā)光量、做出標準曲線(xiàn)、求出濃度和活菌數。通常，細菌表層有細胞膜和細胞壁包裹，故樣品未經(jīng)處理是不能測定的。測定時(shí)需先將樣品與微生物用提取試劑混合，使細胞膜和細胞壁開(kāi)孔，提取出ATP提取試劑是以表面活性劑為基質(zhì)的專(zhuān)用試劑。然后，再與熒光素和熒光素酶生物發(fā)光試劑作用，用熒光儀測定與發(fā)光試劑反應的生物發(fā)光量[4] 。 這種方法可自動(dòng)化操作，靈敏度高，可以達到10-12 mol/L；檢測速度快，相比表面皿培養法，僅需十幾分鐘就可以完成一個(gè)樣本的檢測；檢測范圍廣，此種方法不僅可以檢測微生物，還可以對食品生產(chǎn)設備的清潔度、酵母菌，乳酸菌等菌種的發(fā)酵活性等進(jìn)行檢測。沈陽(yáng)中科靚馬生物工程有限公司從中科院遺傳與發(fā)育所引進(jìn)了“含蟲(chóng)光素基因的新型菌株及蟲(chóng)光素酶的生產(chǎn)方法”發(fā)明專(zhuān)利，成功研發(fā)了具有我國自主知識產(chǎn)權的“ATP熒光法細菌總數快速檢測系統”，系統采用了先進(jìn)的ATP生物發(fā)光技術(shù)，只要測定出相對熒光值，依據相對熒光值與細菌總數的標準曲線(xiàn)，幾分鐘內即可快速得出樣品中的細菌總數[5] 。2008年周愛(ài)玉等對手持式ATP生物熒光檢測儀進(jìn)行研制，取得了良好的結果[6] 。下圖即是兩款不同的類(lèi)型，其中左側被稱(chēng)之為掌上ATP發(fā)光法檢測儀，使檢測更加方便.
2.2 傳統菌落技術(shù)法    菌落總數的測定，一般將被檢樣品制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營(yíng)養瓊脂培養基混合，在一定溫度下，培養一定時(shí)間后(一般為48小時(shí))，記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數量，依據稀釋倍數，計算出每克(或每ml)原始樣品中所含細菌菌落總數。(以下圖片均來(lái)自于互聯(lián)網(wǎng))
3  ATP生物發(fā)光技術(shù)的應用 
   ATP生物發(fā)光法的應用范圍十分廣泛，現已應用于食品行業(yè)的多個(gè)領(lǐng)域。研究表明，ATP生物發(fā)光法與標準的細菌培養菌落計數法相比，二者具有良好的相關(guān)性(r=0.98) [7] ，但怎樣細分細菌種類(lèi)有一定的難度,還需要做大量的工作。利用這種方法可以對食品原料、肉類(lèi)、水產(chǎn)品、蔬菜、飲料、酒類(lèi)、酸奶等中微生物的含量進(jìn)行定量。此外，采用ATP生物發(fā)光法可快速、簡(jiǎn)便地檢測食品生產(chǎn)環(huán)境的清潔度。對ATP 含量的檢測是以相對發(fā)光值(Relative Light Unit ,簡(jiǎn)稱(chēng)RLU)表示的。隨著(zhù)RLU值的降低，微生物的檢出幾率也降低。實(shí)驗證明：如果將RLU值以100～1000作為界限，RLU值不滿(mǎn)100時(shí)，微生物檢出幾率為0，RLU值在100～1000范圍內時(shí)，微生物檢出幾率為30%，RLU值超過(guò)1000時(shí)，微生物檢出幾率為96%。根據這一結果，在日常對食品生產(chǎn)設備或與食品密切接觸設備清潔度的檢測時(shí)，可以將RLU值不滿(mǎn)100時(shí)視為安全，RLU值在100～1000范圍內時(shí)視為要引以重視和注意，RLU值超過(guò)1000時(shí)視為處于微生物污染的危險狀態(tài)[8] ，因此ATP 生物發(fā)光法十分適合HACCP系統的清潔度檢測。此外，還可以用于酵母菌等對毒素的敏感性比較[9] 。近年來(lái)，ATP生物發(fā)光技術(shù)在國內外倍受推崇，在美、日等國食品行業(yè)的質(zhì)量檢測控制領(lǐng)域廣泛應用，有效促進(jìn)食品生產(chǎn)企業(yè)提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益，隨著(zhù)此方法不斷改進(jìn)和完善，生物發(fā)光法可望發(fā)展成為一種較為理想的微生物檢測方法而得到更廣泛的應用，以不斷提高產(chǎn)品質(zhì)量，確保食品質(zhì)量安全。