生物電化學(xué)傳感器測定農藥殘留的研究進(jìn)展 

 摘要：生物傳感器在環(huán)境監測方面具有靈敏及便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)。 以膽堿酯酶的催化活性為基礎的抑制型酶電極和以有機磷水解酶 (OPH)為基礎的直接測定型酶電極近來(lái)研究廣泛、發(fā)展迅速。本文 通過(guò)對傳感器原理以及近1O年酶固定技術(shù)的發(fā)展的敘述，總結了各 種電化學(xué)傳感器的優(yōu)缺點(diǎn)，提供了酶生物傳感器在測定有機磷農藥殘 留的最新研究進(jìn)展。 關(guān)鍵詞：環(huán)境工程；傳感器；酶；電化學(xué)；有機磷農藥 中圖分類(lèi)號：O 657．1：TO 45 文獻標識碼：A O 引 言 農藥是當前農業(yè)生產(chǎn)用于防治病、蟲(chóng)、雜草對農作物危害 不可缺少的物質(zhì)，對促進(jìn)農業(yè)增產(chǎn)有極其重要的作用。據聯(lián) 合國糧農組織報告，1995年全球的農藥銷(xiāo)售量達120萬(wàn)Tl】 。
我國自1993年開(kāi)始禁用有機氯農藥以來(lái)，有機磷農藥被廣泛 濁度計| 色度計| 粘度計| 折射計| 滴定儀| 密度計| 熱流計| 濃度計| 折射儀| 采樣儀| 用于農作物病蟲(chóng)害的防治。據統計1999年我國的農藥產(chǎn)量 為4o萬(wàn)T，其中70％ 為殺蟲(chóng)劑。殺蟲(chóng)劑中有機磷農約占 70％ 。一方面有機磷農藥相對于有機氯等農藥，具有高效，低 生物累積和降解較快 一等優(yōu)點(diǎn)，另一方面長(cháng)期使用有機磷農 藥不僅會(huì )對環(huán)境生態(tài)系統造成影響，而且其還可以在食物鏈 中累積、濃縮，進(jìn)而進(jìn)一步危害人體的身體健康。有機磷農藥 對人體的神經(jīng)系統有不同程度的影響，輕則引起頭痛、惡心、 嘔吐，重則引起肌肉乏力和呼吸困難，接觸過(guò)多甚至會(huì )引起死 亡3；因此發(fā)展簡(jiǎn)便、快速的現場(chǎng)分析技術(shù)對環(huán)境監測、食品 安全及軍隊防御等方面有積極意義。 傳統上二有機磷農藥分析方法主要是利用氣相色譜、液卡H 色譜、薄層色譜、高效液相色譜以及各種光譜連用技術(shù) “ 。
雖然這些方法的選擇性、靈敏度和準確度高，佴其需要昂貴的 儀器設備，樣品的前處理過(guò)程繁瑣、費時(shí)，并且對分析人員的 技術(shù)水平要求很高，不適于現場(chǎng)檢測。 1962年Clark 提出利用酶的特異性，把它和電極組合起 來(lái)用于測定酶的底物的原理。1967年updike等 一成功地利 用其假設研制出用于葡萄糖測定的生物傳感器以來(lái)它的發(fā)展 非常迅速。生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件與轉化 器緊密配合，對特定種類(lèi)化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇 性和可逆響應的分析裝置。傳感器的牛物敏感膜與復雜樣品 中特定的目標分析物之間的識別反應會(huì )產(chǎn)生一些物理學(xué)信號 的變化。這些變化通過(guò)不同原理的轉化器轉換成第2信號， 經(jīng)放大后顯示或記錄。它以其簡(jiǎn)單、快速、靈敏、低成本和便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)彌補 傳統分析技術(shù)的缺點(diǎn)，尤其是以膽堿酯酶(ChE)的催化活 性為基礎的抑制型酶電極和以有機磷水解酶(OPH)為基礎 的直接測定型酶電極已大量用于有機磷的檢測，如熒光檢測 生物傳感器 “j、光導纖維生物傳感器

一、壓電晶體生物傳感 器0 、半導體器件生物傳感器[14 J、光熱檢測生物傳感器 s] 等。在檢測有機磷的傳感器技術(shù)中，電化學(xué)生物傳感器研究 較為廣泛，發(fā)展迅速。本文主要綜述有機磷電化學(xué)生物傳感 器的研究進(jìn)展。
1 膽堿脂酶生物傳感器 膽堿脂酶測定農藥殘留的工作原理是，酶催化底物乙酰 或丁酰膽堿在膽堿脂酶的催化作用下分解形成膽堿和有機 酸，如反應(1)。有機磷及氨基甲酸酯類(lèi)農藥是底物膽堿的結 構類(lèi)似物。它們同膽堿酯酶作用時(shí)，首先形成非共價(jià)的中間 復合物。此復合物很不穩定，極易水解。水解的同時(shí)，磷�；� 與膽堿酯酶活性中心絲氨酸羥基作用生成以共價(jià)結合的磷酰 化酶，如反應(2)，使酶的活性降低，水解反應被抑制，反應產(chǎn) 物減少。而溶液pH值的變化以及膽堿在膽堿氧化脂酶的氧 化下生成的過(guò)氧化氫的濃度的改變或反應中氧的消耗量能被 電化學(xué)傳感器測定。 0 I ～ 一 + CI BuChE cH3- (CH2)2mCmO(CH2)2一N(CH3) butyrylcholine chloride 一 + Cl CH3一(CH2)2一C00+H +H0一(CH2)2一N (CH3)3 (1) butyric acid choline 0 inhibiti0n Enz— Ser一0H+CC13CH2O— P一(OCH3)2 — 0 Enz— Ser—O— P一(OCH3)2+CC13CH20H (2) trichlorfon 1．1 電勢型生物傳感器 反應(1)產(chǎn)生的酸電離使得緩沖溶液的pH值發(fā)生改變， pH值的改變可以通過(guò)離子選擇電極(玻璃電極、金屬和金屬 氧化物電極)和ISFET進(jìn)行測定。pH值的變化量與農藥對酶 的抑制率即農藥濃度成比例，從而可以間接測定農藥殘留。 近年來(lái)報道了使用聚苯胺作為轉換物質(zhì)測定pH值的變 化 。此電極的優(yōu)點(diǎn)在于：在pH值3—9的范圍內，每個(gè) DH的變化量可引起90 mV電勢的變化。 自從20世紀80年代首次將此技術(shù)應用于農藥殘留分析 以來(lái)[ 一，人們一直在不斷地在酶的固定化技術(shù)、基底電極的 選擇以及電極的修飾等上進(jìn)行改進(jìn)。目前對酶的固定技術(shù)方 法已有較深的研究，提出了夾心法、吸附法、共價(jià)鍵合法、凝膠 ／聚合物包埋法、交聯(lián)法以及LB膜技術(shù)一 19]。Kumaran等 ∞ 將丁酰膽堿酯酶交聯(lián)在預活化了的尼龍一聚酰胺膜上，用尼 龍網(wǎng)將載酶膜片固定在pH電極表面，測定土壤萃取液中乙基 對硫磷、速滅靈和二嗪磷的檢出限分別為3．9 ug／g、1．4 ug／g和35 ng／g。Campanella等 在外套聚四氟乙烯的石墨棒頂端覆 蓋一層含PVC PVA PVAc、增塑劑癸二酸鹽以及離子載體三 (十二烷基)胺的聚合體膜(此膜對H 敏感)，另用碳化二亞胺 (carbodiimide)將丁酰膽堿脂酶交聯(lián)固載在尼龍膜上，并用透析 膜及O型圈將其固定于H 敏感膜上，能測定質(zhì)量濃度為1．0 L的對氧磷。Ivanov等_2 調查了銻電極及玻璃電極對有機 磷殺蟲(chóng)劑敵百蟲(chóng)檢測限的影響，根據酶的種類(lèi)、來(lái)源和固定方 法的不同，分別把來(lái)自電鰻的乙酰膽堿脂酶和來(lái)自馬血清的丁 酰膽堿脂酶直接固定在銻電極表面以及商品化的尼龍或硝酸 纖維素膜上，檢出限分別是0．01 mg／I 和0．07 mg／L。Snejdarko— va等t 將乙酰膽堿脂酶交聯(lián)固定在被聚苯胺修飾過(guò)的金電極 表面測定敵百蟲(chóng)和克百威。由于聚苯胺可以提高金電極對 H 的靈敏度，使檢出限分別達到200 nmol／L和6 nmol／L。 ENFET是將酶以共價(jià)結合的方式固定在pH—FET的柵極 絕緣膜上。酶催化酶底物發(fā)生水解反應生成酸，酸電離成氫 離子，這樣就可以引起柵極電流的變化，再通過(guò)漏電流的變化 測定信號l 23一。Dumschat等 J把乙酰膽堿脂酶涂覆在FET的 柵極絕緣膜上， 用預先濃縮就可以測定敵敵畏濃度范圍在 0．3～1．2 mg／L的水樣。Nyamsi Henri等一 將膽堿脂酶、牛血 清蛋白和甘油溶于磷酸鹽緩沖液中，然后將此混合液滴涂在 清洗好的彭pH—ISFET的柵極上，在參比FET上滴上不含膽堿 脂酶的上述混合液，然后在飽和戊二醛蒸氣中交聯(lián)反應25 min，通過(guò)測定兩電極之間的輸出信號差別，可以檢測到l0 mol／L的二異丙基氟磷酸(DFP)。Wan和Nicole等_“ 一比較 了3種不同酶的周定方法的分析特性(見(jiàn)表1)，發(fā)現它們在 酶促反應常數以及電極的壽命、檢出限等方面有所不同：
1．2 電流型生物傳感器 反應(1)中底物用硫代乙酰膽堿代替乙酰膽堿，生成的巰 基膽堿可被氧化而產(chǎn)生電流。以此可設計成電流型生物傳感 器：如果同時(shí)使用膽堿脂酶和膽堿氧化酶，則膽堿氧化酶氧 化反應所消耗的氧或生成的過(guò)氧化氫也可被檢測，以間接測 定有機磷農藥殘留濃度，如反應(3)。 ChO choline + 202+ H20 betaine + 2H2O2 H2O2— 2H +O2+2e一 (3) b Rosa等 用戊二醛、牛血清蛋白與乙酰膽堿脂酶交 聯(lián)固定在尼龍膜上，然后將載酶膜固定在玻碳電極表面制成 生物傳感器，用乙酸一4一氨基苯脂做底物，在250 mV與飽和 汞電極下測定對氧磷和西維因，最低檢測濃度可達4．0 nmol／L和13．0 nmo~L。 由于酶電極中絕緣的蛋白質(zhì)基質(zhì)阻礙了電極表面與氧化 還原酶的活性點(diǎn)問(wèn)的直接信號通訊，第2代酶生物傳感器 使用擴散電子轉移介質(zhì)來(lái)從中導通蛋白質(zhì)氧化還原點(diǎn)和電極 表面間的通訊。Martorell等_3 研究設計了一種只需簡(jiǎn)單拋光 就可以重復使用的酶傳感器。他將碳粉、非導電性環(huán)氧樹(shù)脂、 有機鹽電子媒介體四氰基對醌二甲烷(TCNQ)、酶(AchE或 BChE)的混合液固定在胺化了的硅石粒子(硅石粒子已被硅烷 化)上，以巰基乙酰膽堿或巰基丁酰膽堿(ATCh或BTCh)做底 物，在pH：7．5的0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液+0．1 mol／L KCI，300 mV及以Ag／AgO 為參比電極條件下測定對氧磷，最低檢出限分 別為27．5 L(AchE)和2．8 L(BchE)。此傳感器的優(yōu)點(diǎn)在 于：由于在電極上修飾了氧化還原電子媒介體，底物的電催化氧 化可在較低的電勢下進(jìn)行，從而減少了其他電活性物質(zhì)的干擾。 近年來(lái)越來(lái)越多的研究注重在印刷電極傳感器上。此電 極的優(yōu)點(diǎn)是成本低，可大規模生產(chǎn)和便于攜帶，非常適合實(shí)時(shí) 及在線(xiàn)監測。研發(fā)印刷電極的關(guān)鍵點(diǎn)是生物受體在電極表面 的固定技術(shù)；因為適宜的固定方法不僅能提高電極操作和貯 存的穩定性，縮短響應時(shí)間，還能提高線(xiàn)性范圍和靈敏度。 Gogol等 ]事先將l層nation膜覆蓋在印刷電極上，然后將馬 血清丁酰膽堿脂酶在戊二醛飽和蒸氣下交聯(lián)在此膜上。對敵 百蟲(chóng)、蠅毒磷的檢出限分別為3．5×10一mol／L和1．5×10。 mol／I 。與其他沒(méi)有經(jīng)nation膜修飾的電極相比，它有穩定性 高，工作電勢低，靈敏度不受影響等優(yōu)點(diǎn)。Andreescu等_3 對比 了3種不同酶固定方法對分析特性及農藥檢測的影響(見(jiàn)表 2)：第1種方法是將酶電聚合在聚合膜上，即首先將石墨、TC． NQ和HEC涂覆在工作電極表面，然后再將酶和PVA—SbQ固定 在此膜上；第2種方法是直接把石墨、TCNQ、HEC、凝膠溶液以 及酶的均勻混合液滴涂在工作電極表面，即將酶生物包埋在凝 膠層中；第3種方法是先將石墨、TCNQ、HEC和silica—NTA—Ni 涂覆在工作電極表面，然后再將酶固定在此膜上，即將酶用金 屬螫合固定。當酶的抑制率在10％ 時(shí)，可以分別檢測出1．5× l0一mo1／I⋯1 5×10 mol／L和4．1×10一mol／L的敵敵畏。 表1 不同膜修飾電極分析特性一覽表 Table 1 Analytical Features of Different Biosensors 表2 不同酶固定方法的分析屬性一覽表 Table 2 Analytical features for diferent method of enzym e immobilisation *實(shí)驗條件：0．1 mol／L磷酸緩沖液+0．1 moL／L KC1，pH：8．0： ：【作電壓100 mV，以Ag／AgC1為參比電極；1 mmol／L巰基乙酰膽堿為底物魏福祥等- 用橡膠環(huán)將載酶硝酸纖維素膜固定到銀基 汞膜電極 ，與飽和甘汞電極、鉑對電極組成三電極測試系 統。在抑制率為5％ 時(shí)，測定敵敵畏的檢出限是2．8×10 。 molfL，并且分析周期短，只需40 min，非常適宜進(jìn)行現場(chǎng)快速 監測：Neufeld等 -將流動(dòng)注射技術(shù)與傳感器結合，設計了一 種微量流動(dòng)注射電化學(xué)生物傳感器。電化學(xué)測量系統包括1 個(gè)同定了載酶尼龍網(wǎng)的印刷電極，1個(gè)自制的流動(dòng)注射系統 以及一臺計算機。使用硫代乙酰膽堿作底物，其與六氰合鐵 酸鹽在 【作溶液l{】反應，把[Fe(CN)6] 還原成[Fe(cN)6] 。 ：Fe(CN) ] 一的再氧化能使電極產(chǎn)生尖銳、快速、再現性好的 電信號，在3 min內可以測定5 ng的敵敵畏。 Ciucu等 在用femphthal0cvanine修飾過(guò)的碳糊電極卜 定少量的乙酰膽堿脂酶和膽堿氧化酶，在350 mV Ag／AgCI參 比電極條件下測定被氧化酶氧化生成的H，O，的變化以得出 農藥的含量。用此方法町以測定l0 。mol／I 的對氧磷和呋 喃丹
1．3 電導型傳感器和電流型傳感器的比較 一般來(lái)說(shuō)電流型傳感器的檢出限要比電勢型的低，見(jiàn)表 3 。這是因為電勢型傳感器測定的足H ，而緩沖溶液具有 不同的緩沖能力，削弱了H 的響應。 盡管安培型牛物傳感器被認為測定快速且靈敏度、準確 度高；但電勢型傳感器的使用儀器普遍、小巧，便于攜帶，岡 此更適合野外監測： 目前對食品中農藥殘留的分析主要集中 在電流型生物傳感器上 Schulze等一 在修飾r羥乙基纖維 素(HEC)、TCNQ一石墨的厚膜電極上，用戊二醛交聯(lián)法在其 上固定人工合成乙酰膽堿脂酶及電鰻乙酰膽堿脂酶，在pH： 7．5的10 mmolfI 磷酸鉀緩沖液和0．05 mol／L NaCl溶液的混 合液中，孵化30 min，100 mV及Ag／AgCl參比電極條件下測定 嬰兒食品，能夠檢測到低于5 g／kg的農藥殘留 表3 電導型和電流型傳感器測定有機磷及氨基 甲酸酯類(lèi)農藥的檢出限對照表 Table 3 Detection limits of potentlometrlc and amperometric biosensors for diferent pesticides 農藥 檢出限／(g·L ) 電勢型(pH傳感器) 電流型(硫代膽堿氧化) 涕滅威 1 140 1．9 西維因 l 000 19 呋喃丹 6 0 02 敵敵畏 300 22 1．4 酶活性的再生 用膽堿脂酶測定農藥殘留是利用農藥對酶活性點(diǎn)的抑制 原理，因此在測定完畢后，怎樣恢復酶的活性，使傳感器能反 復使用成為一個(gè)問(wèn)題。目前多使用2一PAM進(jìn)行再生。Gulla 等 一提出用TMB一4代替2一PAM，并作了對比試驗，發(fā)現用 TMB一4進(jìn)行再生， 反復使用11次后酶仍能保持60％ 原來(lái) 的活性，而用2 PAM在6次以后酶的活性不到原來(lái)地50％ 。 2 有機磷水解酶生物傳感器 對于膽堿脂酶傳感器，由于酶 僅對有機磷有抑制作用， 同時(shí)也對氨基甲酸脂類(lèi)農藥有抑制作用；因此它測定的是一 總體含量，選擇性較差。另外在測定時(shí)需要同時(shí)測定抑制前 后的信號，并且孵化時(shí)間較長(cháng)(一般需l0～15 min，甚至更 長(cháng))，這樣整個(gè)分析過(guò)程比較長(cháng)。而有機磷水解酶只對有機磷 農藥有催化水解作用如反應(4)，傳感器直接測定水解產(chǎn)物； 因此與膽堿脂酶抑制法比較起來(lái)，此法簡(jiǎn)單、快速。 Mulchandani等 將含有機磷水解酶(OPH)、BSA和戊二 醛的混合溶液直接涂覆在pH電極的玻璃膜表面，交聯(lián)固化 30～40 min，然后用滲析膜包裹住酶層形成酶電極，最低能檢 測2 M的對氧磷、乙基對硫磷、甲基對硫磷和二嗪磷。雖然 此電位刑傳感器制備較簡(jiǎn)單；但酶需要分離提純，整個(gè)過(guò)程 費時(shí)費力，成本高。 Mulchandani等· 又制作了用碳電極作為基底電極的電 流型酶傳感器。
原理是反應(4)水解產(chǎn)物能在電極的陽(yáng)極上 產(chǎn) 電化學(xué)氧化，其產(chǎn)生的電流與農藥濃度成正比。他們用 印刷技術(shù)制作條形厚膜碳糊電極，并將含OPH的nation溶液 滴涂在電極表面。此傳感器的靈敏度比電勢型的高，對氧磷 和甲基對硫磷的檢出限分別達到9×10 mol／L和7×10 mol／I．。另外此傳感器還顯示出有意思的動(dòng)力學(xué)特性：一方 面只需要10 S便能得到穩定的電流，檢測時(shí)間短；另一方面 其重現性好，對濃度為4．6×10 mol／L的對氧磷進(jìn)行l2次 計時(shí)電流的重復測定，相對偏差只有1．9％。 生物傳感器與流動(dòng)注射技術(shù)的聯(lián)合是一大勢和研究熱 點(diǎn)：兩者的結合能使檢出限降低，適宜于環(huán)境監測、食品分析 和臨床檢測等。Wang|4 一等將經(jīng)過(guò)電活化的金電極浸入胱胺 溶液，氮氣吹于，然后在胱胺表面交聯(lián)上OPH。此電極與流動(dòng) 注射系統相連，能夠得到快速、靈敏和穩定的響應，并且它的 選擇性也非常好，測定對氧磷和甲基對硫磷的線(xiàn)性范圍在l ～ 10 mol／I，，對氧磷的最低檢出限為0．1 tool／L。 3 結 論 有機磷農藥的大量使用對環(huán)境生態(tài)系統破壞以及對人體 健康的影響越來(lái)越引起人們的重視。適于野外快速監測，減 少有機溶劑使用量，測試費用低廉的分析方法亟待開(kāi)發(fā)，以生 物受體作為分子識別元件的生物傳感器正適應于此要求。近 年來(lái)此類(lèi)傳感器技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，測定的靈敏度越來(lái) 越高，響應時(shí)間越來(lái)越短，電極壽命越來(lái)越長(cháng)；然而方法的選 擇性差和生物材料的失活問(wèn)題阻礙了它的商品化、市場(chǎng)化發(fā) 展。相信隨著(zhù)生物以及微電子等技術(shù)的快速發(fā)展，此類(lèi)傳感 器將會(huì )有光明的應用前景。