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以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組

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以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組

摘要:基因組學(xué)新近的進(jìn)展為生物學(xué)的發(fā)現創(chuàng )造了巨大的機遇,抓住這個(gè)機遇需要新穎的試驗設計以及高通量的數據收集和分析系統。隨著(zhù)基因分析系統的靈活性和綜合能力的增強,能夠進(jìn)行單細胞和單分子檢測、適用于整個(gè)基因組、并且能夠高通量的產(chǎn)生和處理巨大的數據平臺的構建成為一種重要的趨勢。由Wisconsin-Madison, WI大學(xué)構建Optical Mapping(可見(jiàn)圖譜)系統便是這些新穎的平臺之一,它能夠以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組。
  基因組學(xué)新近的進(jìn)展為生物學(xué)的發(fā)現創(chuàng )造了一個(gè)巨大的充滿(mǎn)機遇的舞臺。抓住這個(gè)機遇需要新穎的試驗設計、高通量的數據收集和分析系統以及富有創(chuàng )造性的方法去解決以前難以理解的問(wèn)題。隨著(zhù)基因分析系統的靈活性及綜合能力的增強,能夠進(jìn)行單細胞和單分子檢測、適用于整個(gè)基因組、并且能夠高通量的產(chǎn)生巨大的數據平臺的構建正在成為一種重要的趨勢。Optical Mapping(可見(jiàn)圖譜)系統(University of Wisconsin-Madison, WI)作為這類(lèi)新穎平臺的一例,能夠以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組。 電阻計 | 紅外線(xiàn)測溫儀 | 紅外線(xiàn)溫度計 | 頻譜分析儀 | 鉤表 | 多功能測試儀 | 電容表 | 記錄儀 | 色度計 | 剝線(xiàn)鉗 | 電壓計 | 濁度計 | 溫濕度記錄儀
  Optical Mapping 系統通過(guò)收集單個(gè)分子的圖譜形成整個(gè)基因組的物理圖譜。而這些物理圖譜在基因組中能夠反映特殊DNA 序列的位置以及它們之間的物理距離。在插入、刪除、倒置、復制、顛換和重排方面,它們所進(jìn)行的表征和比較對基因組非常有用[1]。通過(guò)創(chuàng )造性地結合DNA 分子的預處理和操作、表面化學(xué)、高速數據收集成像以及一系列的選擇性處理過(guò)程,OpticalMapping 便產(chǎn)生出物理圖譜,這些物理圖譜的特征便是能為基因組學(xué)長(cháng)期存在的問(wèn)題提供新的解決辦法。例如,Optical Mapping 的單分子檢測功能使得它可以對不同種類(lèi)的群體進(jìn)行基因水平上的分析,比如實(shí)性瘤(solid tumor)內或者在細菌菌落里的分子的檢測。從細胞中提取出的DNA 分子可直接成像,而不需要擴增和亞克隆步驟。因此基因的每一部位都可經(jīng)Optical Mapping直接觀(guān)測,使得這一系統成為一個(gè)真正的全基因方法。就此而言,Optical Mapping 系統與那些建立在整個(gè)染色體上進(jìn)行基因比較的低分辨率的細胞遺傳方法具有相似之處。但是,OpticalMapping 的分辨率可以達到幾萬(wàn)個(gè)堿基,這使得該方法適合于低分辨方法辨基因型方法未曾被探索過(guò)的領(lǐng)域的研究。分辨率在幾千個(gè)堿基的全基因分析方法開(kāi)啟了以前難以解決的基因變異問(wèn)題之門(mén),例如:對中等到大的片段插入和缺失的檢測和翻譯。更重要的是,通過(guò)Optical Mapping 檢測基因組多態(tài)性不需要預先知道諸如基因的類(lèi)型、位置等信息,使得這一方法成為名副其實(shí)的“發(fā)現型方法”。最后,Optical Mapping系統的通量相當于在90min 內收集代表一個(gè)人基因組的數據,如此大的通量也使得對于大范圍群體的研究成為可能。在那種條件下,通過(guò)疾病敏感性和藥物響應性基因座位鑒定的相關(guān)研究,整個(gè)人類(lèi)基因組的全部變異都能被直接區分。下文中,作者會(huì )通過(guò)詳細地描述Optical Mapping 系統,列舉出該技術(shù)應用的典型實(shí)例,并把該技術(shù)置于現有基因分析平臺之中來(lái)詳細闡述Optical Mapping 的特點(diǎn)。
1 實(shí)驗
  在Optical Mapping 中,大的基因組DNA分子(300-3000kb 堿基)直接從細胞中提取、延伸,并通過(guò)結合微流控芯片技術(shù)[2]和帶正電的玻璃表面與帶負電的DNA 骨架之間的靜電相互作用使其固定在被特殊處理的玻璃表面上(圖1)。這種固定化技術(shù)相當精妙,以至限制性?xún)惹忻溉院苋菀捉咏麯NA分子,而且產(chǎn)生的限制型片段也能得到很強的保留?汕懈6000~45000 個(gè)堿基對的限制性?xún)惹忻改軌蛴糜谥谱鞲叻直媛实奈锢韴D譜。熒光染料YOYO-1能夠標記表面上的DNA骨架,其形成的單分子圖譜的納米陣列可通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)測。
  不管亞微觀(guān)的DNA 分子的實(shí)際寬度是多少,熒光顯微鏡的數值放大功能使得DNA 分子的寬度有一個(gè)明顯的增加,這樣,被拉長(cháng)的單鏈DNA 分子可很容易地通過(guò)標準的63×物鏡觀(guān)測到。大的、被拉長(cháng)的DNA 分子的性質(zhì)與拉長(cháng)的彈簧相似,當它們緊緊黏附在限制性?xún)惹忻干,只有分子的末端保持松弛狀態(tài),各個(gè)分子之間便形成可以識別的1~2μm 的間隙。與大多數的熒光系統通過(guò)添加探針?lè )肿舆M(jìn)行標記不同,Optical Mapping 以分子間熒光的消失作為標記。添加的探針?lè )肿油ǔ?huì )在標簽周?chē)a(chǎn)生模糊圖案(由于傳統的探針?lè )翘禺愲s交),產(chǎn)生相應的噪音。而這種方法不僅可以避免噪聲的產(chǎn)生,也省去了后續的探針去除步驟。由于限制性?xún)惹忻妇哂刑禺愋院煤涂深A測的特點(diǎn),Optical Mapping 可以保證物理圖譜形成過(guò)程簡(jiǎn)單、準確。
  快速數據收集通過(guò)一個(gè)可測定納米陣列OpticalMapping 的面積的成像系統實(shí)現。與其他物理圖譜方法不同,Optical Mapping 不需要知道碎片大小和序列信息。通過(guò)測量已知大小的DNA分子總的熒光強度,基于熒光強度隨堿基對的變化即可以得到Optical Mapping 的碎片大小。盡管DNA 分子輪廓長(cháng)度發(fā)生了變化,熒光強度仍保持一致,使得碎片大小測量仍很準確。由于D N A 碎片通過(guò)靜電作用被固定在玻璃表面上,因此可實(shí)現單個(gè)分子限制性圖譜的繪制。
  所有的單分子圖譜組合在一起形成一個(gè)包含整個(gè)染色體的圖譜,這一過(guò)程類(lèi)似于序列的組裝。與其他物理圖譜不同,全基因Optical Mapping,又稱(chēng)“一致”圖譜,綜合了成千上萬(wàn)的單分子圖譜!耙恢隆眻D譜上一個(gè)典型的基因座位覆蓋了10~70 個(gè)單分子圖譜。這么大的覆蓋率使得Optical Mapping 比起其他的物理圖譜技術(shù)有更高的準確性[3-9]。由于每個(gè)DNA 分子都能產(chǎn)生一系列離散的數據(限制性酶切碎片圖譜),因而任何一個(gè)(或者每一個(gè))DNA 分子產(chǎn)生的數據相當于瓊脂糖凝膠上的一條完整的帶或者微陣列中的一個(gè)點(diǎn)(見(jiàn)表1 )。這樣,Optical Mapping 系統在一塊芯片上產(chǎn)生一系列大量的類(lèi)似數據,該方法的準確性和精確性已被上千次的實(shí)驗所證實(shí)。
  根據分析的目的,“一致”圖譜和單分子Optical Mapping 都可以通過(guò)硅片雜交定位到相應的序列。就像掃描條形碼鑒定物質(zhì)一樣(圖2),通過(guò)掃描限制性碎片形成的Optical Mapping 圖案(而不是在硅片上的圖譜的圖案)鑒定圖譜相應的序列,進(jìn)而可指認其在基因上的位置。在微陣列雜交試驗中,堿基之間的氫鍵反映相應的目標和參考序列的匹配性,熒光強度的偏差表征多態(tài)性區域。同樣,在硅片雜交中限制性碎片之間的得分可以反映Optical Mapping 和硅片圖譜匹配的程度,而得分減少可表征多態(tài)性區域。硅片雜交的參數能被調整,從而使Optical Mapping 的條形碼與序列準確地對應起來(lái),但是也能很自由地檢測染色體的區別。
2 應用

2.1 從源頭進(jìn)行基因組的構建
  基因組測序依賴(lài)于精確的物理圖譜來(lái)形成和驗證序列數據[1]。傳統的全基因物理圖譜通過(guò)酶切代表性的人工細菌染色體文庫(BAC),以及綜合產(chǎn)生的限制性片段組合成對應的基因組序列,F有技術(shù)如“高信息量指紋圖譜“(HICF)[10]極大地改進(jìn)了以BAC 為基礎的物理圖譜的分辨率和準確度?墒且訠AC 為基礎的技術(shù)由于對橋連大的局部重復的DNA 分子有困難,需要深入的染色體文庫構建,并且單個(gè)樣品需要很大的勞動(dòng)強度,因而使得這一技術(shù)的優(yōu)勢被部分掩蓋。
  Optical Mapping 不僅不存在上述問(wèn)題,而且極大地簡(jiǎn)化了物理圖譜的形成過(guò)程。HICF 形成的指紋圖譜沒(méi)有碎片的序列信息,只是在一個(gè)克隆過(guò)程中形成的大量的無(wú)序碎片。大的DNA 分子被酶切成規則的并具有豐富信息的限制性碎片,而并非簡(jiǎn)單的指紋圖譜。
  Optical Mapping 除了用于表2 給出的基因組研究外,也被用于輔助其他測序過(guò)程,及對一些生物的基因水平研究(耐輻射球菌、惡性瘧原蟲(chóng)、大腸桿菌、白色念珠菌、紅螺菌、鼠疫桿菌、弗氏志賀氏菌、海鏈藻、利什曼原蟲(chóng)等)[3,6,7,11-15]。這些研究證實(shí)了通過(guò)Optical Mapping 系統構建物理圖譜的精確性和穩定性。
2.2 發(fā)現插入缺失的比較基因組學(xué)研究
  Optical Mapping 系統不需要預先知道基因組的序列或結構,因此能很方便地比較相關(guān)的種類(lèi)和分析來(lái)自同一物種中不同成員的多形態(tài)基因組。最近, 未經(jīng)測序的Shigella flexneri Y血清型菌株的Optical Mapping 被構建出來(lái),并與已測序的Shigella菌株的硅片圖譜進(jìn)行比較。在未測序的Y 血清型菌株中發(fā)現了明顯的刪除現象,包括葡糖轉移酶gtrII、gtrAI 和gtrBI,這些轉移酶可能包含在血型的變化過(guò)程中[13]。近來(lái)的研究強調基因改變過(guò)程中的插入和刪除作用( i n d e l s )[16] 。用于檢測indels 的完善系統還處于研究的初期,而推測indels 在人類(lèi)基因組學(xué)中的作用和影響基于高分辨率或者低分辨率的基因組學(xué)方法。Optical Mapping 對人類(lèi)基因組學(xué)的重要貢獻便是發(fā)現了indels以及其他相似的現象如倒置、置換、復制和重排等,而其他高通量的基因組學(xué)平臺很難達到如此高的分辨率。
2.3 基因組異常的完善檢測方法
  比較基因組雜交技術(shù)(CGH)和代表性的低聚核苷酸微陣列分析技術(shù)(ROMA)采用DNA 微陣列檢測微生物和哺乳動(dòng)物基因組中DNA 拷貝數目的改變(圖3)[17,18],這些方法也能夠檢測復制和刪除的存在?墒,這些現象確切的本質(zhì)還不很清楚。擴增區的基因位置不能明確地被標識出來(lái),特別是哺乳動(dòng)物的基因組,低分辨率的CGH 和ROMA 不能準確地測定斷裂點(diǎn)的位置。此外,染色體中基因組外物質(zhì)的移位和插入不能被完全檢測。盡管脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)[19]能夠檢測到諸如轉移等反,F象,但是對哺乳動(dòng)物的基因組則需要預先知道斷裂點(diǎn)及其DNA 印跡;然而低等真核生物能以denono 模式直接檢測染色體的異,F象。另一方面,Optical Mapping 系統能夠直接分析這些異常的染色體,并且可精確檢測和定位基因斷裂點(diǎn)的位置,闡明遷移過(guò)程??通過(guò)成對的單分子限制性圖譜或者條形碼而非參考基因組。單分子圖譜本質(zhì)上講是雜交的圖譜而非硅片圖譜,它們通過(guò)序列數據構建而成,這些很像硅片DNA 印跡法,只不過(guò)這些探針用于校準或者雜交過(guò)程。與所有的限制性圖譜一樣,已完成的Optical Mapping 的分辨率很容易通過(guò)選擇限制性?xún)惹忻傅那懈铑l次來(lái)調整。
3 結論

  Optical Mapping 正從根本上迅速改變基因分析的方法和結果。該技術(shù)的特點(diǎn)??諸如單分子檢測、高通量、全基因研究的策略,為基因組學(xué)研究開(kāi)辟了新的“ 戰場(chǎng)”。未來(lái)的研究工作將集中在人類(lèi)基因組的Optical
Mapping,以及改進(jìn)該系統,增加其適應性方面。例如,由于Optical Mapping的底物分子仍具有生物學(xué)活性,經(jīng)探針標記的二級雜交能被利用產(chǎn)生全基因范圍基礎上的外遺傳現象。發(fā)展“ 可見(jiàn)測序(Optical Sequencing)”會(huì )對單分子Optical Mapping 圖3 全基因方法分析基因失常。普通的染色體異常實(shí)例以及通過(guò)PFG分析、基因微陣列、Optical Mapping 的試驗數據。方法產(chǎn)生杠桿作用,從而使分辨率降低到幾個(gè)堿基對的水平[20,21]。越來(lái)越多基因信息的發(fā)現,更多的問(wèn)題也會(huì )產(chǎn)生。作者非常樂(lè )觀(guān)地認為Optical Mapping 系統能在將來(lái)探索和解決這些問(wèn)題過(guò)程中做出貢獻。
發(fā)布人:2012/9/1 10:45:001123 發(fā)布時(shí)間:2012/9/1 10:45:00 此新聞已被瀏覽:1123次