糖蛋白的糖基化位點(diǎn)和寡糖的異質(zhì)性的快速測定

摘要: 采用鏈霉蛋白酶進(jìn)行酶解可以避免傳統胰蛋白酶酶解法的一些不足。此外，與GlycoX程序結合后，該方法具有適用于高通量大規模的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的潛力。

        糖基化是原核蛋白中最常見(jiàn)的翻譯后修飾形式之一^[1]。糖基化位點(diǎn)和寡糖異質(zhì)性的測定對于理解糖蛋白特殊的生物學(xué)作用是至關(guān)重要的。據估計至少有50%的人源蛋白經(jīng)過(guò)糖基化修飾^[2]。最主要的兩類(lèi)糖基化修飾方式是N端糖基化和O端糖基化。N端多糖經(jīng)氨基連接在天冬酰胺殘基上，具有特定序列N-X-（S或者T）。這里X可以是除脯氨酸外的任意一種氨基酸。N端連接的聚糖具有由兩個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和三個(gè)甘露糖（Man）殘基形成的單核。O端的聚糖連接到絲氨酸或蘇氨酸上，但沒(méi)有單一共同的單核或特定的蛋白序列。

        由于糖蛋白的高度復雜性，糖基化位點(diǎn)分析具有極大的挑戰性。最近有一些關(guān)于糖基化位點(diǎn)分析的報道^[3-11]。常用方法包括以下步驟（見(jiàn)圖1a）：專(zhuān)一蛋白酶的酶解（通常是胰蛋白酶）、糖肽的富集（通常采用液相色譜或親和色譜）和糖肽的質(zhì)譜分析^[7-11]。有時(shí)也可通過(guò)糖肽的去糖基化獲得丟失的聚糖信息^[7,11]。然而許多糖蛋白不易被胰蛋白酶酶解^[12,13]。此外，由于糖基化會(huì )造成胰蛋白酶酶切位點(diǎn)的丟失，因此酶解產(chǎn)生的糖肽太大而不適于質(zhì)譜分析^[9]�；�于上述原因，目前獲得的糖基化信息通常是不完全的。

        作者所在的實(shí)驗室中發(fā)展了一種獨特的能夠同時(shí)測定糖蛋白中N端糖基化位點(diǎn)和寡糖異質(zhì)性的方法（見(jiàn)圖 1b）^[4]。利用該方法，糖蛋白被非專(zhuān)一性的蛋白酶酶解。通過(guò)采用高活性的蛋白酶混合物，即鏈霉蛋白酶，形成大量較短的糖肽（含2~8個(gè)殘基）。糖蛋白的非糖基化部分被酶解成氨基酸和二肽，而糖基化部分被寡糖保護從而抑制了蛋白酶的活性。采用裝有多孔石墨化碳（PGC）的固相萃�。⊿PE）柱可以很容易地將產(chǎn)生的糖肽與氨基酸和鹽分離。同時(shí)，糖蛋白用 N-糖酰胺酶F(PNGase F)處理。PNGase F能夠從糖蛋白中專(zhuān)一地切割N端糖基。然而該操作僅對于具有幾個(gè)糖基化位點(diǎn)的較大糖蛋白是必要的,較小的糖蛋白不需要單獨地測定寡糖的組成。在任何情況下釋放的聚糖可采用裝有PGC的SPE柱純化。純化的糖肽和聚糖可采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）和高精度的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR-MS）進(jìn)行分析。采用后者可以完成對任一糖基化位點(diǎn)的確認和聚糖異質(zhì)性分析。

1 鏈霉蛋白酶酶解

        先將約10 nmol的糖蛋白溶解在0.1 mol/L Tris 緩沖液（pH 7.5）中，再用約10個(gè)單位的鏈霉蛋白酶處理。上述溶液在37 ℃放置36~48 h。同時(shí)，采用PNGase F在37 ℃ 條件下酶解糖蛋白12 h，釋放 N端連接的聚糖。采用裝有PGC的SPE柱純化由非專(zhuān)一蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的糖肽和由PNGase F釋放的寡糖。將裝有PGC的SPE柱依次用水和含有0.05％（v/v）三氟乙酸（TFA）的80％乙腈（ACN）/水（v/v）沖洗。再將酶解的糖蛋白或寡糖溶液上樣到PGC柱上。隨后用去離子水以1 mL/min的流速沖洗，去除鹽和緩沖液。最后分別用含有0.05％TFA的10％ACN、20％ACN和40％ACN洗脫糖肽和多糖。在進(jìn)行MALDI分析前，將每一次洗脫液分別收集并真空濃縮。

2 質(zhì)譜

        質(zhì)譜采用配備7.0 特斯拉磁場(chǎng)和用于離子化的脈沖摻釹釔鋁石榴石（Nd：YAG）激光（355 nm）的外源HiResMALDI（IonSpec Corp., Irvine, CA）。采用溶于5 mg/100 μL乙醇的2,5-二羥基安息香酸（DHB）作基體；采用飽和的氯化鈉（或者氯化鉀）-甲醇溶液作摻雜劑，以產(chǎn)生糖肽和寡糖的堿金屬相關(guān)的準分子離子。將1 μL糖肽/寡糖溶液和1 μL的基體溶液依次滴加到MALDI靶體。樣品在空氣流中干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。示波器 | 電阻計 | 可燃氣體檢測儀 | 粒子計數器 | 傳送器 | 鉤表 | PH計 | 萬(wàn)能鉗 | 溫濕度儀 | 溶氧計 | 試驗機 | 溫度記錄儀 | 鹽度計 

3 糖基化位點(diǎn)的表征

        為了驗證該實(shí)驗策略，對一個(gè)具有單一糖基化位點(diǎn)（⁶⁰N）和已知寡糖結構的模式糖蛋白核糖核酸酶B進(jìn)行了表征^[14]。由鏈霉蛋白酶酶解后分離出的糖肽的正離子模式質(zhì)譜圖如圖 2a所示。該譜圖是在沒(méi)有經(jīng)過(guò)高效液相色譜（HPLC）分離而只采用最簡(jiǎn)單的樣品預處理后獲得的。由于被酶解為氨基酸，大的非糖肽碎片并沒(méi)有出現。觀(guān)察到的大于m/z 1 000的譜峰對應的是糖肽，這是因為寡糖配基的質(zhì)量單位至少為800（GlcNAc2Man3）。在譜圖中出現了兩個(gè)糖肽系列（空心和實(shí)心的方塊分別代表系列1和系列2），分子質(zhì)量相差162 Da（1個(gè)甘露糖殘基）。樣品中添加NaCl可獲得更多的信息。摻雜劑能增強系列1中5個(gè)峰的相對強度，這與鈉離子的加成物相關(guān)（圖 2a）。另一系列是質(zhì)子化樣品，其強度隨著(zhù)NaCl的加入而降低。

        為了鑒定圖 2a中的多肽碎片，采用PNGase F將多糖從糖蛋白中釋放出來(lái)，并用MALDL-MS進(jìn)行分析（圖 2b）。圖 2a中觀(guān)察到的5個(gè)多糖峰代表5個(gè)糖肽，其信號分別相應于組成從GlcNAc- 2Man5到 GlcNAc2Man9的高甘露糖寡糖與鈉離子的加成物。相鄰譜峰的質(zhì)量差是162 Da，相當于一個(gè)甘露糖殘基。圖 2b中的5個(gè)多糖的信號相對強度與圖 2a中5個(gè)糖肽的一致。

        通過(guò)從糖肽質(zhì)量中減去觀(guān)察到的多糖質(zhì)量可以對多肽碎片進(jìn)行鑒定。例如，圖 2a系列2中的第一個(gè)峰（m/z 1 505.456）對應的是帶有多糖GlcNAc-2Man5（m/z 1 257.420）的糖肽。肽段的質(zhì)量可以由觀(guān)察到的糖肽質(zhì)量1 504.45 Da（[M+H]⁺減去H⁺）減去觀(guān)察到的多糖質(zhì)量1 216.42（[M+Na]⁺ 減去 Na⁺和H₂O）獲得。多肽的質(zhì)量288.12 Da相當于糖基化位點(diǎn)在⁶⁰N的二肽精氨酸-天冬氨酸（RN）（理論質(zhì)量288.15 Da）。理論質(zhì)量與實(shí)驗質(zhì)量的差異通常小于20 ppm，因此可以斷定系列2中的糖肽包含帶有從GlcNAc2Man5 到 GlcNAc2Man9的高甘露糖寡糖的二肽RN。系列1中質(zhì)量最小的峰(m/ z 1 371.39)對應著(zhù)帶有寡糖GlcNAc2-Man5的糖肽（m/z 1 257.42）。132.07 Da的肽段質(zhì)量對應的是天冬氨酸（理論質(zhì)量132.05 Da），因此系列1中的糖肽包含1個(gè)單個(gè)N端殘基。為了證明可根據離子的相對豐度進(jìn)行定量分析，圖 3給出了每個(gè)多糖的相對豐度測定結果。因為這些多糖的結構、大小和離子化效率相似，因此可以計算出糖蛋白中寡糖的相對豐度^[15]。

        根據上述策略，可以確定從簡(jiǎn)單到復雜的糖蛋白中的專(zhuān)一糖基化位點(diǎn)，并獲得內在的位點(diǎn)異質(zhì)性信息。通過(guò)對模式蛋白如核糖核酸酶B和雞卵清蛋白（含有兩個(gè)潛在的位點(diǎn)，其中一個(gè)由計算得出）的分析，驗證了結果的準確性。對于更復雜的含有未知糖基化位點(diǎn)的糖蛋白如來(lái)源于有爪蟾蜍（XL）和非洲蟾蜍（X）卵子的腦皮層顆粒凝集素（CGL1和CGL2）也進(jìn)行了研究。分布在XL CGL2中N端糖基化位點(diǎn)上的多糖如圖 4所示。采用該策略，也可對更復雜的糖蛋白如包括了7個(gè)潛在的未知糖基化位點(diǎn)的葡萄糖氧化酶進(jìn)行分析。

4 GlycoX程序

        作者的實(shí)驗室還開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的用來(lái)幫助分析實(shí)驗數據的電腦程序??GlycoX^[16]。這個(gè)軟件是在MATLAB基礎上發(fā)展的，需要把質(zhì)譜圖以ASCII文檔形式輸入。它是利用已知蛋白序列的精確的糖肽和多糖質(zhì)量來(lái)判斷N端和O端連接的糖基化位點(diǎn)和微小的異質(zhì)性。該程序能自動(dòng)分析由非專(zhuān)一性或者低專(zhuān)一性蛋白酶水解（例如：鏈霉蛋白酶E或蛋白酶K）得到的糖肽質(zhì)譜圖。它具有三個(gè)主要功能：糖基化位點(diǎn)的搜索功能，用來(lái)判斷糖蛋白的糖基化位點(diǎn)以及寡糖的異質(zhì)性；寡糖計算功能，用來(lái)判斷寡糖的組成是N端連接、O端連接還是經(jīng)化學(xué)修飾的寡糖；自動(dòng)同位素過(guò)濾功能，用來(lái)從糖肽、肽和多糖質(zhì)譜圖中選擇單一的同位素峰。GlycoX流程圖如圖 5所示。

        將質(zhì)量強度（M/I）表（以ASCII格式保存）和從SWISS-PROT/TrEMBL數據庫（FASTA格式，以文本文件保存）中獲得的對應的糖蛋白的序列輸入到GlycoX程序中。為了確定糖基化位點(diǎn)和對應的多糖，對經(jīng)同位素過(guò)濾的質(zhì)量進(jìn)行分析，從而確定它們和哪種多糖和肽段質(zhì)量對應。通過(guò)比較從單肽到用戶(hù)定義的最大長(cháng)度的肽段序列可以判斷肽段的組成。利用該程序，也可以搜索匹配的分析量來(lái)判斷多糖的質(zhì)量。此外，也可以利用光譜來(lái)確認多糖的質(zhì)量。對復雜的糖基化位點(diǎn)的分析，推薦采用多糖譜圖對比的方法。

        采用鏈霉蛋白酶酶解可以避免常用的胰蛋白酶酶解的一些缺點(diǎn)。此外，GlycoX程序具有適用于高通量大規模的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的潛力。