一種應用于液相色譜分析和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜分析的微型分散器 摘要: 一種含有聚合物整體柱且能夠調節液滴的壓電裝置用來(lái)將蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的洗脫液點(diǎn)樣到基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)樣品靶上進(jìn)行肽段指紋圖譜分析。牛血清白蛋白(BSA)酶解肽段經(jīng)過(guò)液相梯度洗脫后可以提高序列覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定的可信度。
肽段指紋圖譜(PMF)是一種基于肽段質(zhì)量檢測的蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜技術(shù),常用于藥物靶點(diǎn)和生物標記物發(fā)現的差異表達分析中[1,2]。PMF實(shí)驗的效率與蛋白質(zhì)酶解肽段片段被鑒定的數目相關(guān)。當細胞和組織的量受限制時(shí),在樣品中的蛋白質(zhì)濃度降低的同時(shí)保證蛋白質(zhì)鑒定的可信是目前研究的挑戰之一。由于高低豐度分析物離子的競爭造成肽段檢測數目降低的問(wèn)題更加嚴重[3,4],這將引起離子抑制以及減少低豐度肽段和蛋白質(zhì)的檢測數量,從而降低目標蛋白質(zhì)的序列覆蓋率。在質(zhì)譜分析中,微型液相色譜(LC)分離可以明顯地提高肽段和蛋白質(zhì)樣品的檢測靈敏度[5-7]。液相色譜分離技術(shù)可以將高低豐度的蛋白質(zhì)分開(kāi),降低檢測過(guò)程中的離子抑制效應[8],從而可以提高目標蛋白質(zhì)的序列覆蓋率。多樣的微型液相色譜分離模式可以單獨運行也可以與其他如親和捕獲、離子交換、體積排阻色譜聚焦和反相色譜模式聯(lián)用[9-11]。 氣體
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溫濕度記錄儀 PiezoLC(MicroFab Technologies, Inc., Plano, TX, 專(zhuān)利申請中)是一種微量噴射進(jìn)樣系統,用其可以將經(jīng)色譜分離的微量體積(0.1~100 nL)蛋白質(zhì)酶解肽段點(diǎn)到基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)的樣品靶上供后續的質(zhì)譜分析。一種多孔的聚合物整體材料固定在玻璃毛細管的噴射分散裝置上用來(lái)進(jìn)行肽段的色譜分離。這些肽段樣品首先進(jìn)樣到整體色譜柱上(反相基質(zhì)),然后洗脫緩沖液流經(jīng)色譜柱時(shí)將肽段洗脫分離。洗脫的肽段以液滴的形式從壓電的裝置孔出來(lái),點(diǎn)到MALDI-TOF-MS的樣品靶盤(pán)上,仍然保留著(zhù)色譜分離后的狀態(tài)。肽段將在一定時(shí)間后進(jìn)行多重分析。
PMF分析中,蛋白質(zhì)和肽段的量往往受到限制,需要微型化的流體操作技術(shù)。PiezoLC噴射進(jìn)樣裝置采用一根聚合物整體柱并且只需要很少體積(<10μL)的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物。甲基丙烯酸基質(zhì)的聚合物分離材料不需要填充顆粒填料和篩板,很難被整合到微小流速的裝置中并且會(huì )干擾液流[12]。大孔聚合物整體材料的反壓低,這對于系統分散裝置來(lái)說(shuō)極其重要。通過(guò)紫外光引發(fā)聚合可以為整體柱固定形狀和位置。多種化學(xué)物和功能單體可以被整合到一根整體柱上,如強陽(yáng)離子交換(SCX)和反相(RP)。不僅如此,這些色譜柱具有的快速傳質(zhì)能力,使得其具有強大而快速的分離能力[13]。
PiezoLC裝置是一種非常有用的工具,能夠從有限的樣品中對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和表征。PMF應用實(shí)驗中肽段采用噴射系統進(jìn)樣進(jìn)行色譜分離后可以明顯地降低離子抑制效應并且提高M(jìn)ALDI-TOF-MS的分辨率。對牛血清白蛋白(BSA)的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離分析時(shí),與對照組相比,該方法鑒定了大量的肽段,具有非常高的氨基酸序列覆蓋率,提高了蛋白質(zhì)鑒定的可信度。
1 方法 1.1 BSA溶液的酶解
BSA蛋白質(zhì)溶液酶解過(guò)程按照Kinter等人[14]的方法進(jìn)行。將蛋白質(zhì)與20μg的胰蛋白質(zhì)酶(Promega, Madison, WI)混合后在37 ℃條件下反應過(guò)夜。
1.2 整體柱的制備 。1)硼硅酸鹽基質(zhì)的玻璃毛細管乙烯化。整體聚合物(丁基甲基丙烯酸-乙烯二甲基丙烯酸) 毛細管柱按照Lee 等人[15]的方法制備。PiezoLC硼硅酸鹽基質(zhì)的玻璃毛細管的內表壁需要乙烯化用來(lái)共價(jià)連接整體聚合物。
。2)混合物的聚合。乙烯化的硼硅酸鹽基質(zhì)的玻璃毛細管利用不透光的絕緣帶掩蓋并充滿(mǎn)以下聚合混合物:16%(v/v)乙烯二甲基丙烯酸,24%(v/v)丁基甲基丙烯酸,59%(v/v)1-正癸醇以及1.0%(v/v)2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。充滿(mǎn)聚合混合物的毛細管在ELC 4001(Electro-Lite Corp., Danbury, CT) 365 nm 15 mW/cm2 紫外燈下照射15 min。反相聚合物整體材料的孔徑經(jīng)測定為2.2μm。
。3)PiezoLC微型分散裝置的構建。含有整體材料的玻璃毛細管裝配到PiezoLC微型分散進(jìn)樣裝置中(見(jiàn)圖1)。不同的整體柱位置對應于不同的分散孔進(jìn)行了多種分散測試。在液滴形成和分散過(guò)程中干擾最小的整體柱在毛細管中的位置如圖2所示。
1.3 洗脫實(shí)驗 。1)基質(zhì)溶液。將重結晶的α-CHCA(α-cyano-α-hydroxycinnamic acid)(LaserBio Labs, Sophia-Antipolis, France)溶解于350 g/L溶液中,其中含有等量的1-丙醇、甲醇、1-丁醇和乙腈(Sigma-Aldrich)。利用帶有55μm噴射孔(PN MJ-AT-01-55, MicroFab Technologies, Inc.)的PiezoLC微型分散進(jìn)樣裝置,將含有0.1%(v/v)三氟乙酸(TFA)的α-CHCA溶液沉積在不銹鋼的MALDI樣品靶盤(pán)上(PN DE1271TA,Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD),每個(gè)點(diǎn)為100 nL。
。2)色譜柱上樣。PiezoLC裝置用200μL 70%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)TFA沖洗,然后再用200μL 0.1%(v/v)TFA沖洗。BSA的酶解產(chǎn)物(50 fmol/μL)上樣到柱上,然后再用200μL 0.1%(v/v)TFA沖洗。
。3)梯度洗脫。梯度洗脫程序為濃度每次變化5%,從5%增加到70%。這一過(guò)程采用包含等量的1-丙醇、甲醇、1-丁醇、乙腈(Sigma- Aldrich)溶液和0.1%(v/v)TFA溶液(EBD1洗脫緩沖液)來(lái)實(shí)現。每個(gè)洗脫步驟以6.0μL/min的流速將體積為100 nL的洗脫液過(guò)量的上樣到12 個(gè)基質(zhì)靶點(diǎn)。以70%的EBD1作為洗脫緩沖液時(shí)等度洗脫的BSA酶解產(chǎn)物作為參照。
。4)MALDI-TOF-MS和PMF。在反射模式下進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析實(shí)驗,所用儀器為Axima CFR MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Shimadzu Scientific Instruments),每個(gè)樣品點(diǎn)100張譜圖,并且每張圖10個(gè)激光點(diǎn)疊加產(chǎn)生。光譜通過(guò)質(zhì)量為1439.811 7 Da和2 045.027 9 Da的兩個(gè)肽段進(jìn)行內標校正。峰形平滑方法為Savitsky-Golay法,其帶有梯度質(zhì)心峰抓取方法。將利用Axima軟件生成的單一同位素質(zhì)量產(chǎn)生的數據,上載到MASCOT PMF搜索軟件中進(jìn)行分析[16]。SwissProt數據庫搜索時(shí)采用多種修飾(脲甲基半胱氨酸修飾)并且其肽段質(zhì)量容忍度為±0.2 Da。
2 結果 2.1 MALDI-TOF-MS譜圖
圖3顯示的是所有從PiezoLC裝置中經(jīng)每個(gè)臺階梯度洗脫下來(lái)的BSA酶解產(chǎn)物的MALDI-TOFMS譜圖,其采用的梯度條件為5%~70%的EBD1 洗脫液。
在對照組的等度洗脫中,序列覆蓋率和被鑒定的肽段數分別為30%和17。采用臺階梯度PiezoLC分離的同樣量的BSA酶解產(chǎn)物,得到的結果為序列覆蓋率為56%,總共鑒定出38個(gè)肽段(圖4)。與對照組相比,該方法的序列覆蓋率提高了87%,鑒定的肽段數提高了124%。在50%,55%,65%和70%的臺階洗脫中經(jīng)MASCOT軟件搜索后沒(méi)有發(fā)現明顯的與BSA蛋白質(zhì)相對應的肽段。這些結果與其他的PiezoLC BSA產(chǎn)物洗脫實(shí)驗的結果一致。
3 結論 一種含有聚合物整體柱且能夠根據需要點(diǎn)樣的裝置用來(lái)將蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的洗脫液點(diǎn)樣到MALDI-TOF-MS樣品靶上進(jìn)行PMF分析。經(jīng)過(guò)臺階梯度洗脫方法對BSA酶解產(chǎn)物進(jìn)行LC分離分析時(shí)可以提高序列覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定的可靠性。這種微型方法非常有利于PMF的蛋白質(zhì)酶解樣品分析中低濃度的蛋白質(zhì)的PMF分析,為蛋白質(zhì)組樣品分析提供了新的裝置。