高效液相色譜柱和分離操作的條件的選擇 

 一、硅膠 
基質(zhì)填料
　　1、正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。

　　由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，
分離 
的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（MethyleneChloride）等。

　　2、反向色譜反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向
色譜 
所使用的流動(dòng)相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會(huì )在色譜柱上有更強的保留。

　　常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

　　二、聚合物填料聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1—14均可使用。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類(lèi)填料具有更強的疏水性；大孔的
聚合物 
對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效�，F有的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。

　　三、其它無(wú)機填料其它HPLC的無(wú)機填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構體，由于在HPLC
流動(dòng) 
相中不會(huì )被溶解，這類(lèi)柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可以在PH高達12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH1-14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是最近幾年才開(kāi)始研究，加之面臨的實(shí)驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行之中。

　　怎樣選擇填料粒度目前，商品化的色譜填料粒度從1um到超過(guò)30um均有銷(xiāo)售，而目前分析分離主要用3和5um填料進(jìn)行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近 30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著(zhù)在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數或分離能力，但是柱長(cháng)更短，以縮短分析時(shí)間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。
氣相色譜的影響條件主要有載氣種類(lèi)、流速 
、柱溫、
汽化 
溫度、柱長(cháng)、柱內徑、進(jìn)樣時(shí)間和進(jìn)樣量等。

　　根據范第姆特方程，流速是影響塔板高度的重要因素，通常選擇稍高于最佳流速的載氣流速；載氣流速大時(shí)，應選擇相對分子量小，擴散系數大的 H2，Ne等作載氣，反之選擇相對分子量大，擴散系數小的N2，Ar等作載氣；

　　提高柱溫可以提高傳質(zhì)速率，提高柱效，但柱溫過(guò)高又會(huì )使組分間分離度減小。采用較低的柱溫，減少固定相的用量和適當增加載氣的流速，可在短時(shí)間內獲得良好的分離效果；
　　汽化溫度應以能使試樣迅速汽化而不產(chǎn)生分解為準，通常比柱溫高20-70℃，柱溫應比試樣中各組分的平均沸點(diǎn)低20-30℃，對于沸點(diǎn)范圍較寬的試樣，宜采用程序升溫；
　　增加柱長(cháng)會(huì )提高分離度，但分析時(shí)間增長(cháng)，因此，一般在滿(mǎn)足一定分離度的條件下盡可能用短柱子；
　　進(jìn)樣應在1秒以?xún)韧瓿�，以減小峰變寬；
　　最大允許的進(jìn)樣量應該控制在使基線(xiàn)構成之面積稱(chēng)峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064Wh/2h>峰面積或峰高與進(jìn)樣量呈線(xiàn)性關(guān)系的范圍內。