一種用于乳酸檢測的新型微流控芯片

摘　要　基于光度吸收原理,設計了一種集成片上混合和光纖檢測功能于一體的微流控芯片,用于細胞和組
織培養過(guò)程中乳酸代謝濃度的在線(xiàn)檢測。通過(guò)光學(xué)設計軟件( Zemax)優(yōu)化設計了吸收光路,得到微流控芯片
溝道寬度為250μm,利用計算流體動(dòng)力學(xué)軟件(CFD)模擬確定了乳酸和顯色劑片上混合時(shí)微流控芯片溝道
的溶液完全混合位置和光纖檢測點(diǎn),采用微電子機械系統(MEMS)加工了基于聚二甲基硅氧烷( PDMS)的微
流控芯片,將片上混合和光纖檢測功能集成在一個(gè)以PDMS和載玻片組成的芯片上。實(shí)驗結果表明,該芯片
成功實(shí)現了乳酸和顯色劑的片上混合和實(shí)時(shí)檢測,檢出限(LOD)為0. 52 mmol/L ( 47 mg/L) ,乳酸濃度從
1 mmol/L變化至5 mmol/L時(shí)的芯片響應時(shí)間為130 s,能夠滿(mǎn)足細胞和組織培養過(guò)程中乳酸在線(xiàn)檢測要求。
關(guān)鍵詞　乳酸,微流控芯片,片上混合,光纖檢測,微電子機械系統(MEMS)

1　引　言
基于微電子機械系統(MEMS)技術(shù)的生物微反應器在細胞和組織培養中顯示出越來(lái)越多的優(yōu)越
性,成為組織工程的研究熱點(diǎn)[ 1～4 ] 。實(shí)時(shí)獲取細胞或組織的生存狀態(tài)是考察生物微反應器培養質(zhì)量的
重要依據。生物微反應器中培養液的乳酸代謝濃度直接表征了細胞或者組織的活性[ 5, 6 ] 。因此,實(shí)現
對乳酸代謝濃度的直接、非接觸及實(shí)時(shí)檢測對生物微反應器而言具有重要意義。
電化學(xué)檢測[ 7 ]和光度吸收法[ 8 ]為乳酸的常規檢測方法。電化學(xué)檢測需要電極和培養液接觸,電極
的引入不可避免造成對培養液的污染,尤其是生物微反應器的培養液用量很少,易引起檢測結果的偏
差。采用常規分光光度檢測方法,則需要對生物微反應器培養液定期取樣,取樣間隔長(cháng)短影響了檢測精
度,無(wú)法精確獲取細胞和組織的真實(shí)生存狀態(tài)。
Wu等[ 9 ]根據光度吸收原理設計了一種光纖檢測的微流控芯片,可以代替傳統細胞培養過(guò)程中乳
酸代謝濃度的分光光度檢測方法,實(shí)現了乳酸代謝濃度的非接觸檢測。但該芯片不具備乳酸和顯色劑
片上混合功能,無(wú)法滿(mǎn)足生物微反應器乳酸代謝濃度的直接、實(shí)時(shí)檢測。在此基礎上,本研究基于光度
吸收原理,研制了在一種集片上混合和光纖檢測于一體的微流控芯片,實(shí)現了對乳酸代謝濃度的直接、
非接觸、實(shí)時(shí)檢測。頻譜分析儀| 電池測試儀| 相序表| 萬(wàn)用表| 功率計| 示波器| 電阻測試儀| 電阻計| 電表| 鉗表| 高斯計| 電磁場(chǎng)測試儀|
2　實(shí)驗部分
2. 1　芯片設計
所研制的微流控芯片具有片上混合和吸收光度檢測的功能,因此芯片由光纖光度檢測器和微混合
器兩部分組成。所設計的芯片結構如圖1所示。Y型蜿蜒折疊溝道和光纖插入溝道均由聚二甲基硅氧
烷( PDMS)和載玻片組成,其中A,B, ., F為培養液不同更新速度時(shí)的光纖檢測位置, I1、I2分別為乳酸
和顯色劑入口,O為廢液出口。
根據朗伯2比爾定律,當入射光波長(cháng)和芯片溝道寬度一定時(shí),透光率隨乳酸濃度改變而變化。在所
設計的光纖光度檢測器中,光源通過(guò)光纖耦合到PDMS膜壁,穿過(guò)培養液和PDMS膜壁再耦合到另一側
 
光纖進(jìn)入接收器。光傳輸過(guò)程中經(jīng)過(guò)多個(gè)不同折射率的界面,勢必會(huì )造成光傳輸的損失,降低檢測靈敏
　圖1　芯片結構示意圖
Fig. 1　Structure ofmicrofluidic chip
A～F: 不同流速下的光纖檢測位置( op tical fibre detecting po2
sitions under different flow rates) , I1, I2. 乳酸和顯色劑的入口
( inlets of lactate and reagent) , O: 廢液出口(outlet ofwaste ) 。
度。因此,獲得較高的光傳輸效率成為設計的關(guān)鍵
之一。通過(guò)光學(xué)模擬軟件對溝道寬度進(jìn)行優(yōu)化設
計,以期獲得較理想的檢測靈敏度。
微混合器按照是否采用動(dòng)力分為主動(dòng)式和被動(dòng)
式兩種[ 10 ] 。主動(dòng)式混合器混合效果優(yōu)于被動(dòng)式,但
需要額外的動(dòng)力,增加了芯片設計和加工的難度。
本研究選擇了被動(dòng)式混合器�；旌掀鞑捎肶型蜿蜒
折疊溝道,通過(guò)流體的自擴散完成片上混合功能,采
用計算流體動(dòng)力學(xué)(CFD)軟件模擬計算出最佳混合
點(diǎn)位置,由此可確定光纖檢測器的放置位置。
2. 2　芯片制作
微流控芯片由PDMS和載玻片組成,利用MEMS工藝制作而成。加工工藝主要包括SU8模具工藝
和PDMS工藝,如圖2a所示。
首先在清洗干凈的硅片上甩SU8 2100膠(美國MicroChem) ,厚度控制在150μm,利用掩模版在雙
面光刻機(Karl SussMA6, 德國SUSS公司)曝光,顯影后( SU28顯影液,英國Ship ley Europe 公司)在硅
片上制成SU8模具。然后對SU8膠模具進(jìn)行表面處理,將按照一定比例混合而成的PDMS ( Sylgard l
184, 美國Dow Corning公司)液體倒入模具中,在常溫下凝固2～3 h。待PDMS凝固后將其從SU8模具
上剝離;在成型的PDMS微流控芯片上溝道末端位置開(kāi)孔,采用R IE (反應離子刻蝕)對PDMS膜進(jìn)行表
面處理[ 11 ] ,然后將其與清洗干凈的載玻片通過(guò)化學(xué)鍵直接結合在一起,構成可逆封裝(圖2b) 。將光纖
插入芯片的光纖溝道,在顯微鏡下對準,使得光纖端部正好位于溝道兩側而不破壞溝道,如圖2c所示。
這樣即可獲得具有片上混合和光纖檢測功能的微流控芯片。
圖2　加工工藝流程( a) 、微流控芯片( b) 和光纖與溝道結構( c)
Fig. 2 　Microelectromechanical system (MEMS) p rocessing ( a ) , microfluidic chip ( b ) and the position
between channel and op tical fibre ( c)
2. 3　實(shí)驗裝置
采用中心波長(cháng)568 nm的發(fā)光二極管(LED,美國Hewlett Packard公司)作為光纖光度檢測器的激發(fā)
光源,通過(guò)光纖耦合器( ST,英國Afonics Fiberop tics公司)耦合到光纖(HFBR0410, 62. 5 /125 μm,美國
Agilent Technologies公司)端面,在另一側通過(guò)相同的光纖及耦合器至光電二極管( PXR0108,英國Afon2
ics fiberop tics公司)作為接收器,由此光信號通過(guò)自制的微弱電流放大器轉換為電壓信號,通過(guò)12位數
據采集卡(ADC212,英國Pico Technology公司)送到PC機中進(jìn)行記錄。
2. 4　實(shí)驗方法
所有的實(shí)驗均在避光暗室中操作。為了獲得精準曲線(xiàn),取0、1、2、4和5 mmol/L乳酸各10μL,顯色
劑( lactate reagent,愛(ài)爾蘭Trinity Biotech PLC公司)各100μL。其它試劑均為分析純。水為去離子水。
采用多路注射泵( PHD 2000,美國Harvard Apparatus公司)將乳酸和顯色劑分別注入微流控芯片的
兩個(gè)入口。精確調整注射泵管直徑,使得乳酸和顯色劑的進(jìn)樣速比為1∶10,滿(mǎn)足乳酸混合顯色需要。
第5期王軍波等:一種用于乳酸檢測的新型微流控芯片
在乳酸入口,依次注入0、1、2、4和5 mmol/L的乳酸溶液,待信號穩定后分別記錄不同濃度下的輸出響應。
3　結果與討論
3. 1　光學(xué)模擬
利用光學(xué)設計軟件(Zemax@ 10. 0)進(jìn)行光學(xué)模擬,研究芯片溝道寬度對光傳輸效率的影響。
根據加工條件,選擇PDMS膜壁厚度為0. 07 mm,折射率為1. 45,所用乳酸近似為水溶液,折射率為
　圖3　溝道寬度對的光纖傳輸效率的影響
Fig. 3　Effect of channelwidths to transmittance efficiency
1. 33。光纖孔徑0. 4, 0. 8 mmi. d. 、1. 5 mm o. d. ;發(fā)
光二極管LED光源中心波長(cháng)568 nm。
光學(xué)模擬結果如圖3 所示�？梢钥闯�,隨溝道
寬度增加,光纖傳輸效率降低。當溝道寬度< 300
μm時(shí),光傳輸效率> 90%�？紤]增大溝道寬度可以
提高檢測靈敏度,兼顧加工工藝因素,選擇溝道寬度
為250μm,傳輸效率為0. 91。
3. 2　溝道內溶液混合的流體動(dòng)力學(xué)模擬
利用計算流體動(dòng)力學(xué)( computational fluid
dynamics, CFD)軟件( FLUNENT@ 6. 2)進(jìn)行乳酸和
顯色劑在溝道內的溶液混合模擬,研究溝道長(cháng)度對溶液混合效果的影響。
根據芯片的加工條件和上述優(yōu)化設計的結果,溝道寬度250μm,深150μm。按照生物微反應器中
培養液更新速度要求,計算培養液流速0. 1～2μL /min范圍時(shí)乳酸和顯色劑能夠完全混合完畢時(shí)的溝
道長(cháng)度。
芯片設計乳酸和顯色劑溝道寬度相同。為滿(mǎn)足光度吸收乳酸和顯色劑1∶10體積比例要求,乳酸和
顯色劑的流速比1∶10,即顯色劑的流速范圍1～20μL /min。
通過(guò)CFD軟件模擬計算,得到乳酸流速與完全混合完畢所需溝道長(cháng)度的關(guān)系曲線(xiàn),其線(xiàn)性回歸方
程為:
L = 65. 947v + 0. 0003 (1)
其中, L 為溝道長(cháng)度(mm) , v為乳酸流速(μL /min) �；貧w方程相關(guān)系數r = 1. 000�？梢�(jiàn)溝道長(cháng)度和乳
酸的流速成正比,即和培養液的更新速度成正比。也就是說(shuō)培養液的更新速度越快,所需的溝道長(cháng)度越
長(cháng)。
3. 3　顯色反應時(shí)間對溝道長(cháng)度的影響
實(shí)驗表明,乳酸和顯色劑完全混合后需一定顯色反應時(shí)間達到光度檢測的最佳值。2 mmol/L乳酸
和顯色劑完全混合后,反應時(shí)間和檢測信號之間的關(guān)系如圖4所示。所采用的檢測儀器為分光光度計。
可以看出,在完全混合后較短的時(shí)間內,光度吸收率迅速上升,達到一定吸收率后隨時(shí)間延長(cháng)而降低。
因此,選擇完全混合后光度吸收率最高值對應的時(shí)間為最佳檢測時(shí)間(6 min) ,計算出不同流速下
的所需要的完全混合并反應充分的溝道長(cháng)度,獲得不同流速下的光纖檢測位置。圖5為芯片不同位置
乳酸和顯色劑混合效果的顯微圖像(乳酸和顯色劑的流速分別為0. 1和1. 0μL /min) 。
3. 4　檢出限和響應時(shí)間
為檢驗微流控芯片的混合效果和檢測靈敏度,分別采用96孔板和微流控芯片進(jìn)行溶液混合和檢
測。微流控芯片的乳酸檢測校準曲線(xiàn)回歸方程為:
ychip = 0. 176c - 0. 1141 (2)
孔板混合后的檢測校準曲線(xiàn)回歸方程為:
y96 p late = 0. 0652c + 0. 0522 (3)
以上兩式中, ychip和y96 p late分別為微流控芯片和96孔板無(wú)量綱檢測相對值, c為乳酸濃度(mmol/L) ,回
歸方程的相關(guān)系數分別為0. 9925和0. 9902。實(shí)驗表明,微流控芯片混合和檢測結果顯示出更好的線(xiàn)
性度,靈敏度(0. 176 mmol/L)也明顯高于96孔板(0. 0652 mmol/L) 。

　圖4　吸光度與反應時(shí)間關(guān)系
Fig. 4 　Relationship between absorbance and
reation time
　圖5　芯片入口處( a) ,中間段( b)和檢測點(diǎn)附近( c)的顯微圖
Fig. 5　Microscopy ofmixing on chip at the inlet position ( a) , the
middle position ( b) and near the detection point ( c)
圖6a為采用微流控芯片測試不同乳酸濃度的梯度曲線(xiàn)。根據信號檢測3σ原則,計算出微流控芯片
的檢出限(LOD)為0. 52 mmol/L (47 mg/L) ,可以滿(mǎn)足細胞培養過(guò)程中乳酸代謝濃度檢測的精度要求。
圖6b為采用微流控芯片時(shí)系統的響應時(shí)間。先后通入1和5 mmol/L濃度的乳酸,可以發(fā)現130 s
后即可檢測到乳酸濃度的變化,可以滿(mǎn)足檢測的實(shí)時(shí)性需要。