顯微成像光譜儀技術(shù)的研究及應用
摘要：顯微成像光譜儀技術(shù)足一種生物組織檢測方法，目前廣泛應用于生物醫學(xué)檢測和疑難病癥分析，已成為組 織檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。論述r顯微成像光譜儀各結構功能模塊的工作原理及特點(diǎn)，并時(shí)其各主要技術(shù)指標進(jìn)行了分 析。介紹了目前的發(fā)展現狀，并對所出現的多種顯微成像光譜儀的技術(shù)方案及特點(diǎn)做了詳細的總結。研究結果表明，顯 微成像光譜技術(shù)作為一種新的技術(shù)手段，必將在l臨床醫學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)以及分析化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應用。

 l 引 言 近些年來(lái)，生物醫學(xué)一直是國際上的熱點(diǎn)研究 領(lǐng)域，而生物技術(shù)的飛速發(fā)展也對新型先進(jìn)顯微觀(guān) 測技術(shù)的研究提出了越來(lái)越高的要求。自從熒光顯 微鏡出現以后，尤其是在1957年自Marvin Minsky 把共焦顯微技術(shù)引入熒光觀(guān)測領(lǐng)域以來(lái)，共焦熒光 顯微鏡技術(shù)就以其獨有的特點(diǎn)一直在生物組織研究 中發(fā)揮著(zhù)重要作用l1]。自20世紀80年代成像光譜 儀技術(shù)出現以來(lái)，光學(xué)成像技術(shù)與光譜技術(shù)得到了 有機地結合，它不僅能對物體進(jìn)行形貌成像，而且還 能提供豐富的光譜信息。由于它具有高光譜分辨 率、多譜段、圖譜合一等優(yōu)點(diǎn)，所以在遙感領(lǐng)域獲得 了巨大的成功 J。 最近幾年，國際上開(kāi)始出現了將熒光顯微技術(shù) 與成像光譜交叉的～種新的研究方向，即顯微成像 光譜技術(shù)。由于它在獲得樣品結構圖像信息的同時(shí) 可獲得超高細分的光譜信息，也就是說(shuō)可以得到樣 品信息的數據立方體，包括一維的光譜信息和兩維 的空間信息，所以為生物醫學(xué)分析、礦物質(zhì)研究和發(fā) 光材料微結構分析提供了更加豐富的信息量，這在 生物、醫學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域具有極大的應用價(jià) 值。由于顯微成像光譜儀的獨特優(yōu)點(diǎn)，最近幾年在 國際上得到了廣泛的研究。在國內，南開(kāi)大學(xué)、天津 大學(xué)、西安光機所、長(cháng)春光機所和上海技術(shù)物理研究 所等也都開(kāi)展了這方面的研究 作【3__ J。

2 顯微成像光譜儀的定義和功能模塊 顯微成像光譜儀技術(shù)是在普通的 微技術(shù)的基 礎上引入目前發(fā)展迅速的成像光譜理論而得到的一 種新型的光學(xué)探測技術(shù)。它的工作原理如圖l所 示。主要包括光源、顯微機構、光譜成像機構、掃描 (推掃)機構和后續計算機處理五個(gè)模塊。由光源發(fā) 出的光，經(jīng)濾光片、反射鏡、顯微物鏡后照射在樣品 上。激發(fā)的熒光或樣品 表面的反射光再次通過(guò) 顯微物鏡、反射鏡、半透 半反鏡進(jìn)入成像光譜儀， 最后成像在成像光譜儀 的像面CCD上，經(jīng)計算 機讀出數據和光譜、圖像 圖l 顯微成像光 譜儀結構原理圖 找 物 f 重構程序進(jìn)行處理，得到所需要的目標圖像和光譜 圖。計算機操控樣品臺上下和左右移動(dòng)，以實(shí)現樣 品的三維掃描成像。
主要功能模塊及其特點(diǎn)：
(1)光源模塊。光源模塊是用來(lái)照明樣品使其 產(chǎn)生反射或激發(fā)樣品使其產(chǎn)生熒光。照明方式可分 為透射式和反射式兩種。根據分析樣品的不同需要 選擇不同的光源。在照明樣品探測吸收光譜時(shí)，一 般選用Hg燈等寬譜段光源。在激發(fā)樣品探測熒光 光譜時(shí)，要根據激發(fā)樣品所需的光源波段的不同選 擇單色儀或激光器作為激發(fā)光源。
(2)顯微模塊。顯微模塊實(shí)現對樣品的空間分 辨，一般選擇普通顯微光學(xué)系統。近年來(lái)，為了提高 探測熒光圖像的空間分辨率，激光掃描共焦熒光顯 微系統也得到了極大的應用。
(3)成像光譜模塊。成像光譜模塊主要實(shí)現儀 器的光譜分光。目前采用的分光方式主要分為色散 分光和干涉分光。色散型是一種傳統的分光方式， 技術(shù)上比較成熟，已經(jīng)得到了大量的應用。但其能 量利用率比較低。干涉型分光方式，尤其是傅里葉 變換成像光譜儀，由于它具有高光譜分辨率、高能力 利用率、多通道的特點(diǎn)，所以取得了飛速的進(jìn)展，成 為了成像光譜研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。
(4)掃描(推掃)模塊。顯微成像光譜儀結構是 通過(guò)計算機操控樣品臺進(jìn)行移動(dòng)的。利用樣品臺的 平動(dòng)實(shí)現對樣品的推帚成像；利用樣品臺的上下移 動(dòng)，實(shí)現對樣品的斷層掃描成像。為了獲得準確的 光譜圖像，必須對樣品臺的掃描(推掃)機構的運動(dòng) 速度進(jìn)行精確的設計、控制。一般通過(guò)計算機控制 步進(jìn)電機來(lái)驅動(dòng)樣品臺的精確運動(dòng)。
(5)后續計算機處理模塊。后續處理模塊包括 數據采集、數據定標、數據重構三個(gè)系統。數據采集 系統指的是對(xD 探測器數據的讀出、采集、傳輸、 控制、存儲和實(shí)時(shí)顯示等。數據定標指的是通過(guò)測 定成像光譜儀對一個(gè)已知輻射特性目標的響應，得 到儀器的儀器函數，從而可根據成像光譜儀所獲取 的數據準確得到所觀(guān)察目標的超光譜圖像信息。數 據鶯構系統是指對數據進(jìn)行變換等處理，實(shí)現對數 據的三維重構，獲得可視化的樣品內部結構圖像信 息和光譜分布信息。

3 主要技術(shù)指標 顯微成像光譜儀技術(shù)是成像光譜技術(shù)與顯微技 術(shù)結合的產(chǎn)物，因此它的一些技術(shù)指標是相互制約 和相互綜合的結果。顯微成像光譜儀系統的主要指 標的確定需要考慮系統的綜合性能和兩分系統相互 制約等因素。
(1)光譜范圍。光譜范圍主要根據處理的樣品 特性和分光方式而定，一般根據反射光吸收光譜的 范圍或所激發(fā)的熒光光譜的范圍來(lái)確定系統的工作 光譜范圍。
(2)譜段數。譜段數的選取主要根據CCD面陣 相機的光譜像元數的多少而定，沒(méi)有嚴格的標準。 但對采用傅里葉變換干涉儀的分光系統來(lái)說(shuō)，為了 能實(shí)現快速傅里葉變換(FFT)和提高數據處理速 度，一般選擇譜段數為2的整數次冪
(3)空間分辨率�？臻g分辨率主要由顯微物鏡 的數值孔徑、放大倍率和CCD像元大小而定。在采 用激光掃描共焦熒光顯微系統中，空間分辨率可比 普通顯微系統的空間分辨率提高大約1．4倍。
(4)光譜分辨率。光譜分辨率主要與分光系統 的設計有關(guān)。在色散型分光系統中，光譜分辨率與 分光計的狹縫寬度有關(guān)。狹縫越窄，光譜分辨率越 高，但系統的光能利用率隨之降低，因此一般在保證 足夠光通量的前提下，減小狹縫寬度，以提高光譜分 辨率。在干涉型分光系統中，光譜分辨率與狹縫寬 度無(wú)關(guān)，只與系統的最大光程差有關(guān)。

4 顯微成像光譜儀設計原理及工作特點(diǎn) 隨著(zhù)顯微成像光譜儀技術(shù)的飛速發(fā)展，世界各 國的科學(xué)家們研制了很多種采用不同技術(shù)手段的顯 微成像光譜儀方案。這些不同的技術(shù)手段主要集中 在光譜分光方式上。根據成像光譜中分光機理特點(diǎn) 的不同可以把它們分為兩類(lèi)：一類(lèi)是色散分光型，它 包括光柵型、棱鏡型和濾光片分光型；另一類(lèi)是干涉 分光型，主要包括基于Michelson干涉儀的動(dòng)鏡型 和基于變形Sagnac干涉儀的空間調制型。

4．1 基于光柵一棱鏡一光柵組合分光的顯微成像 光譜技術(shù) 圖2所示為上海技術(shù)物理研究所的研究人員設 計和研制的一種顯微高光譜成像儀的原理圖，它是 基于光柵一棱鏡一光柵分光方式的l9j。整個(gè)系統的光 譜范圍為400～800nm，譜段數為120個(gè)，光譜分辨 R2l 率小于5nm，空間分辨率可達到1．125／,m。 一CCD 抓測器 什 圖2 基于光柵．棱鏡一光柵組合分光 的顯微成像光譜儀結構原理圖 處于顯微鏡載物臺上的樣品被柯勒照明系統照 明，瞬時(shí)視場(chǎng)內的樣品條帶通過(guò)顯微鏡物鏡成像在 分光計的狹縫處，然后再經(jīng)過(guò)光譜分光組件后，在垂 直于樣品條帶方向按光譜色散，最后成像在CCD像 面上。CCD光敏面平行于狹縫的一維稱(chēng)為空間維， 垂直于狹縫的一維稱(chēng)為光譜維，在空間維每一行光 敏元上得到的是樣品條帶的一個(gè)光譜波段的像，面 陣CCD相機每幀圖像便對應于一個(gè)樣品條帶的多 光譜圖像。通過(guò)載物臺自動(dòng)裝置對樣品進(jìn)行推掃， 就可得到整個(gè)樣品的二維圖像和光譜數據，即數據 立方體。 棱鏡、光柵分光是一種傳統的、技術(shù)發(fā)展比較成 熟的分光方式，基于棱鏡或光柵分光的光譜儀器的 主要缺點(diǎn)是系統信噪比受通光孑L、狹縫的限制，通光 孑L、狹縫越窄，光譜分辨率越高，但系統接收到的能 量也隨之降低。

4．2 基于線(xiàn)性可變?yōu)V光片的顯微光譜技術(shù) 圖3為一種基于 線(xiàn)性可變?yōu)V光片分光 的顯微成像光譜儀的 結構原理圖。它由顯 微鏡、線(xiàn)性可變干涉 濾光片、微動(dòng)平臺、 CCD攝像頭、圖像采 集卡和計算機六大部 分組成【10 J。其原理 是，由光源發(fā)出的光 圖3 基于線(xiàn)性町變?yōu)V光片 的熒光顯微成像光譜 儀的結構原理圖 經(jīng)反射鏡和聚光鏡照明載物臺上的樣品，樣品的物 光經(jīng)過(guò)顯微物鏡、半透半反鏡、45。棱鏡和目鏡可供 人眼觀(guān)察，或通過(guò)成像物鏡和線(xiàn)性可變干涉濾光片 成像在CCD攝像頭的感光面上，CCD攝像頭的輸 出連接圖像采集卡，圖像采集卡連接計算機。 線(xiàn)性可調濾光片是一種新型的分光方式，這種 儀器的結構設計比較簡(jiǎn)單。目前存在的主要問(wèn)題是 透光效率低、光譜范圍有限、光譜分辨率較低，另外 波長(cháng)調諧時(shí)存在像移。

4．3 基于動(dòng)鏡型干涉儀的顯微成像光譜技術(shù) 822 圖4足基于Michelmn動(dòng)鏡型干涉儀的顯微成 像光譜儀的結構原理圖。由樣品點(diǎn)出射的光，經(jīng)過(guò) 微物鏡和半透半反鏡進(jìn)入Michelmn f：涉儀。由 于動(dòng)鏡的循環(huán)往復運動(dòng)，所以町在CCD探測器光敏 面上得到隨時(shí)問(wèn)變 化的干涉圖，通過(guò)對 干涉圖的傅 葉變 換就可以復原出光 譜信息。 在該系統中，由 于系統的光譜分辨 罔4 基Ⅲ『Michelin動(dòng)鏡型干涉 儀的娃微成像光譜儀結構原理圖 率由系統的最大光程差決定，所以具有很高的光譜 分辨率。另外，由于它不含狹縫，光能利用率高。其 缺點(diǎn)是：由于動(dòng)鏡只有循環(huán)運動(dòng)一個(gè)周期后才能得 到一個(gè)完整的干涉圖對其進(jìn)行變換處理，所以不適 于}央速變化的光潛測量；動(dòng)鏡要求勻速運動(dòng)，對傾 斜、晃動(dòng)等參數要求很?chē)栏�，所以該系統不適合應用 于現場(chǎng)實(shí)地檢測。

4．4 基于Sagnac干涉儀的顯微成像光譜技術(shù) 圖 Sagnac 微成像 構原理 統中，Sagnac干涉 5 藎于 g 涉儀的 儀通過(guò)分束器橫向 顯微成像光譜儀結構原理圖 剪切每一束光線(xiàn)，得 到兩束互相平行且具有一定光程差的光線(xiàn)；在CCD 光敏面上將兩束光線(xiàn)收集在一個(gè)點(diǎn)上，根據相干特 性產(chǎn)生干涉圖；通過(guò)推掃載物臺，對每一行樣品進(jìn)行 分析；最后再通過(guò)傅里葉變換復原出光譜信息。 在陔裝置中，由于沒(méi)有運動(dòng)部件，因此具有良好 的穩定性和可靠性，適合于野外現場(chǎng)工作；雖然它與 色散型分光方式一樣，都依靠一個(gè)狹縫來(lái)實(shí)現推掃 方向的空間分辨，但其光譜分辨率與狹縫寬度無(wú)關(guān)， 因此可以在空間分辨率允許的情況下，加寬狹縫，從 而增大視場(chǎng)角、提高能量利用率。該結構的缺點(diǎn)是， 由于其光譜分辨率由最大光程差決定，而最大光程 差由沒(méi)計時(shí)橫向剪切儀的剪切量決定，因此限制了 該方案的光譜分辨率。

4．5 基于線(xiàn)陣針孔推掃的激光掃描共焦顯微成 像光譜儀LP．I~SMIS技術(shù) 如圖6所示，系統分為共焦顯微光學(xué)子系統和 空間調制型成像光潛光學(xué)子系統。線(xiàn)陣檢測針孔陣 列既位于共焦顯微子系統中的線(xiàn)陣光源針孔陣列的 共焦位置，又位于成像光譜子系統中的傅里葉透鏡 誘函～ 一孓 的前焦面，所以它既是 顯微系統的像面，又是 成像光譜系統的物面。 在線(xiàn)陣檢測針孑L位置 所成的樣品點(diǎn)的像被 分束器在傅里葉透鏡 的前焦面橫向剪切為 兩個(gè)虛像，它們經(jīng)過(guò)傅 里葉透鏡，最后被柱面 鏡在C(=I=)探測器上收 集，并發(fā)生干涉，得到 干涉圖。最后通過(guò)對 分柬器 罔6 基于線(xiàn)陣針孔推豐1的 激光掃描共焦顯微成像 光譜儀結構原理 干涉圖的變換，復原出樣品點(diǎn)的光譜信息。 在該顯微成像光譜儀技術(shù)方案中，由系統得到 的干涉圖的強度分布為 r 』(A)= I‘B(v)co~rtvAdv √ I r = I B(v)cos(2~vd：r／．／ )dv (1) √ I 樣品點(diǎn)的光譜分布可由于涉圖強度分布的傅里葉變 換得到： r十／ B(v)= I，(A)co~rtvAdA J ～， r F， = I，(A)cos(2rtMx／f )dz5 (2) J 一， 在該方案中，線(xiàn)陣檢測針孑L陣列是其關(guān)鍵部件。 線(xiàn)陣檢測針孔陣列的離焦不僅會(huì )影響裝置的光譜分 辨率和空間分辨率，而且會(huì )極大地降低儀器的性能， 對由裝置獲取到的生物組織的光譜信息和圖像信息 的正確性產(chǎn)生影響。因此必須設計良好的調整和裝 配工具，盡可能的減少系統的離焦量，以期獲得理想 的干涉圖分布。 LP—L( MIS裝置相對于以前研究的顯微成像 光譜儀來(lái)說(shuō)具有三個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：較高的光譜分辨率； 由于采用了掃描共焦顯微光學(xué)系統，相對于基于普 通顯微系統的顯微成像光譜系統來(lái)說(shuō)，具有較高的 空間分辨率和軸向深度解析力，能重構出組織內部 的三維圖像，實(shí)現立體成像；由于采用了空間調制成 像光譜技術(shù)，相對于基于棱鏡、光柵和濾光片等分光 元件的色散型顯微成像光譜技術(shù)來(lái)說(shuō)，能夠提供更 大的光通量，適合于弱光探測，這在生物醫學(xué)研究領(lǐng) 域顯得更為重要。

5 應 用 雖然顯微成像光譜儀技術(shù)的研究工作是最近幾 年才開(kāi)始興起的，目前尚處于探索性研究階段，但它 在很多領(lǐng)域已顯示出潛在的應用前景。 生命科學(xué)是顯微成像光譜技術(shù)最具有影響力的 應用領(lǐng)域。它可以廣泛應用于染色體識別、癌癥診 斷、皮膚病榆查、細胞功能研究、蛋白質(zhì)相互作用研 究等許多方面。另外它還可以與多熒光探針標記分 析技術(shù)相融合，得到試樣更加豐富的信息。顯微成 像光譜技術(shù)在材料領(lǐng)域也有著(zhù)廣闊的應用前景，特 別是對發(fā)光材料的分析，例如Si基納米材料的研 究⋯J。在石油化工領(lǐng)域，它可以用于分析含油巖心 表面的熒光光譜信息和空間信息，研究巖心中的石 油運移，判斷原生油層【I2j。

6 結論 顯微成像光譜儀技術(shù)的出現在顯微領(lǐng)域實(shí)現了 圖像分析和光譜分析技術(shù)的有機結合，不僅具有空 間分辨能力，而且還具有光譜分辨能力。由于顯微 成像光譜技術(shù)所具有的獨特優(yōu)點(diǎn)，使其研究取得了 巨大的進(jìn)展，出現r各種各樣的技術(shù)手段和方案。 分析了顯微成像光譜技術(shù)的各功能模塊及主要特 點(diǎn)，總結r其主要技術(shù)指標，并對目前出現的各種有 代表性的技術(shù)方案及其特點(diǎn)做了分析�？梢钥闯�， 顯微成像光譜技術(shù)作為一種新的技術(shù)手段，它必將 會(huì )在臨床醫學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)以及分析化學(xué)等領(lǐng)域 得到廣泛的應用。