PCR檢測的質(zhì)量控制

隨著(zhù)獸醫防疫工作重要性的逐步提高，PCR檢測技術(shù)已被獸醫工作者比較廣泛認可，已經(jīng)從實(shí)驗室研究走進(jìn)了臨床應用階段。如何提高PCR檢測質(zhì)量，已成為實(shí)驗室技術(shù)人員不可回避的一個(gè)問(wèn)題，它直接影響實(shí)驗室檢測結果的可信度和獸醫防疫工作質(zhì)量。
       我們認為，PCR檢測質(zhì)量的控制是一個(gè)系統工程，總體上涉及三個(gè)方面：一是試驗儀器；二是試驗試劑與耗材；三是人員操作。任何一個(gè)方面出現問(wèn)題，都會(huì )影響PCR檢測質(zhì)量。

一、試驗儀器

       PCR儀和紫外凝膠成像系統（紫外分析儀或手提紫外等）以及移液器都可能影響PCR檢測的質(zhì)量。PCR儀是控制PCR反應溫度變化的，其溫度和控制時(shí)間的準確程度可能會(huì )影性PCR檢測質(zhì)量。移液器取液的準確程度影響反應體系是否能達到最佳反應環(huán)境。紫外分析系統對檢測敏感性有明顯的影響。紫外分析系統有3種類(lèi)型儀器：紫外分析儀、紫外凝膠成像系統、手提紫外燈。紫外分析儀直接用眼睛觀(guān)察瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶。紫外凝膠成像系統是在計算機上通過(guò)攝像系統對瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶進(jìn)行觀(guān)察。手提紫外燈可以在電泳過(guò)程中直接對瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶進(jìn)行觀(guān)察，使用方便，分辨率比較低。依據這些儀器的分辨率由高到低順序是紫外分析儀、紫外凝膠成像系統、手提紫外燈。紫外分析儀有時(shí)能看到弱陽(yáng)性擴增帶，在紫外凝膠成像系統上卻看不到。手提紫外燈只有在陽(yáng)性擴增帶比較亮時(shí)才能看到，建議為保證檢測質(zhì)量最好不用手提紫外燈，可用于臨時(shí)的電泳結果觀(guān)察。
       儀器的質(zhì)量控制應該通過(guò)實(shí)驗室質(zhì)量認證來(lái)實(shí)施，定期進(jìn)行儀器的效驗。沒(méi)有質(zhì)量認證的實(shí)驗室可以定期請儀器生產(chǎn)廠(chǎng)家進(jìn)行效驗和保養，確保所有儀器處于正常的工作狀態(tài)。

二、試驗試劑與耗材

       在PCR檢測質(zhì)量控制中，試劑的選擇具有十分重要的作用，也是實(shí)驗人員最為關(guān)注的檢測質(zhì)量控制因素。試劑一定選擇質(zhì)量和信譽(yù)好的廠(chǎng)商，一但選定后最好不要輕易改換。如果必須改換時(shí)應與原產(chǎn)品進(jìn)行嚴格比對試驗，包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗。并且經(jīng)常要注意不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異。比如說(shuō)TaqDNA聚合酶，不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的質(zhì)量是有差異的，盡管都是標出相同活性單位，但其標定方法和保存液的成分以及運輸過(guò)程的不同常常導致實(shí)際活性單位是有差異的，有時(shí)由于其活性低，使得弱陽(yáng)性樣品漏檢；有時(shí)由于其活性過(guò)高出現非特異擴增。這與ELISA檢測中酶結合物的作用相似。其實(shí)影響PCR檢測結果的試劑很多，可以這樣說(shuō)，PCR檢測用的所有試劑都可能影響檢測效果�？刂圃噭┑馁|(zhì)量是作好PCR檢測前提。我們認為：最好是選擇PCR試劑盒來(lái)控制試劑質(zhì)量。
       評價(jià)一種PCR試劑盒，除了考慮它的敏感性、特異性、穩定性、操作簡(jiǎn)便程度外，還應包括：試劑盒提供的試劑覆蓋整個(gè)PCR檢測試驗的程度。如果試劑盒提供了整個(gè)PCR檢測試驗的試劑，表明該試劑盒對PCR檢測試驗的試劑具有了全程控制性能。相反，PCR檢測的試劑的質(zhì)量控制程度比較低，意味著(zhù)檢測質(zhì)量可控程度低。例如：溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用，如果在陽(yáng)光下長(cháng)時(shí)間的照射下失效了，在紫外燈下發(fā)熒光效能降低，可能會(huì )造成一些弱陽(yáng)性樣品的漏檢，出現假陰性。其它試劑出現問(wèn)題也是一樣影響檢測質(zhì)量。試劑盒在生產(chǎn)過(guò)程中，有一套試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制體系。每一試劑組分都經(jīng)過(guò)靈敏度、敏感性、特異性質(zhì)量控制的檢測，在有效期內能確保每種試劑的質(zhì)量。因此，選擇試劑盒進(jìn)行PCR檢測是比較理想的控制方法。在PCR檢測中，最好全部使用試劑盒提供試劑，對PCR檢測質(zhì)量控制有益。
       實(shí)驗耗材也是影響PCR檢測質(zhì)量的因素之一。PCR反應管薄厚以及傳導熱量性能等直接影響PCR檢測效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油，但有些PCR反應管蓋子不嚴密，導致擴增過(guò)程中反應液水份蒸發(fā)，嚴重影響檢測靈敏度。PCR反應體系是微量的，移液器的Tip頭生產(chǎn)質(zhì)量不好時(shí)，有時(shí)致使液體殘留量多或洪吸作用強，導致試劑盒中試劑量不夠，配置PCR反應體系不準，造成檢測質(zhì)量下降。
       在每次PCR檢測時(shí)，一定設立陰性對照樣品和陽(yáng)性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時(shí)，表明試驗全部過(guò)程的試劑沒(méi)有受到污染；陽(yáng)性對照樣品檢測為陽(yáng)性時(shí)，表明DNA提�。≧NA提取、RNA反轉錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽(yáng)性對照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。因此，每次試驗都應設立表明DNA提�。≧NA提取、RNA反轉錄）、DNA擴增和電泳鑒定對照，只有設立試驗全程的對照，才能證明試驗結果成立。這一點(diǎn)對PCR和RT-PCR檢測試驗是非常重要的。
       陽(yáng)性對照在試劑盒中是必須有的組分。設立陽(yáng)性對照有3種類(lèi)型：第一種是用檢測的病原微生物作為陽(yáng)性對照。這樣的直接對照優(yōu)點(diǎn)是直觀(guān)、準確、本次試驗完整條件對照，可以說(shuō)明此次試驗是否成立。缺點(diǎn)是對檢測過(guò)程中增加了PCR污染的指數。另外，不能表明每個(gè)檢測樣品對照成立。第二種是設立一種與檢測病毒無(wú)關(guān)微生物作為陽(yáng)性對照。風(fēng)速計| 照度計| 噪音計| 輻照計| 聲級計| 溫濕度計| 紅外線(xiàn)測溫儀| 溫濕度儀| 紅外線(xiàn)溫度計| 露點(diǎn)儀| 亮度計| 溫度記錄儀優(yōu)點(diǎn)是降低了PCR污染的危險性，并且提高了試劑盒的生物安全性。缺點(diǎn)是僅是參考陽(yáng)性對照，不夠直接、完全反映本次試驗成立，也不能表明每個(gè)檢測樣品對照成立�？蛇m合怕污染的實(shí)驗室或要求生物安全等級高的病原微生物的檢測。第三種是在每個(gè)反應管內設立參考對照，除了陽(yáng)性擴增帶之外，又設立一條擴增帶，指示每個(gè)反應管內檢測情況。檢測為陽(yáng)性時(shí)出現兩條不同大小擴增帶，陰性時(shí)出現一條擴增帶。這種對照設立技術(shù)要求高，成本也高些，對照效果是最理想的，可以排除每個(gè)檢測樣品操作失誤或試劑出現問(wèn)題對檢測造成的影響。由于在一個(gè)反應管內對兩條模板同時(shí)進(jìn)行擴增，相互之間多少有一定的干擾，因此，對病原微生物檢測靈敏度或多或少有一定影響。此種對照方式可能會(huì )成為PCR對照的發(fā)展趨勢。

三、人員操作

       我們多名實(shí)驗室人員曾經(jīng)對相同樣品同時(shí)進(jìn)行檢測，檢測結果確實(shí)存在差異。經(jīng)常檢測人員比其他實(shí)驗人員檢測的靈敏度高10~100倍。說(shuō)明PCR檢測的試驗確實(shí)有一定的操作技術(shù)需要熟悉和訓練，不同的人員對檢測結果有一定的影響。加強人員的操作技能的訓練是必須的，需要實(shí)驗技術(shù)人員對PCR檢測有一個(gè)熟練的過(guò)程。 
        PCR污染控制是PCR檢測操作人員必須非常注意一項內容。實(shí)驗室設置上分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區。物流應按分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區順序，嚴禁倒流。人員操作也應非常注意，比如注意經(jīng)常打掃衛生消毒、對移液器要定期進(jìn)行清洗、消毒。及時(shí)試驗操作簡(jiǎn)便、快速、準確等。