采集何首烏藥材薄層色譜指紋圖譜

中藥何首烏(Radix Polygoni Muhiflori)為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb．)的干燥塊根[1] ，主產(chǎn)于我國廣東、四川、湖南、貴州、河南等省區[2]，具補肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發(fā)之功效�，F代研究表明何首烏主要含蒽醌類(lèi)、二苯乙烯苷類(lèi)和磷脂類(lèi)等有效成分，其藥物效應各有不同 [3]。作為我國一種名貴中藥材，何首烏野生資源日益緊缺，人工栽培品受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等因素影響尚缺乏從品種到質(zhì)量的統一規范，不同產(chǎn)地何首烏質(zhì)量評價(jià)已引起廣泛重視 [4-5]。薄層色譜指紋圖譜具有色譜的彩色圖像特征性強，展開(kāi)劑選擇范圍廣，組成十分靈活等特點(diǎn)，應用于中藥的質(zhì)量控制，可以綜合地、直觀(guān)地反映藥材的內在質(zhì)量[6]。本研究采用薄層色譜分析，初步建立不同來(lái)源何首烏藥材的指紋圖譜，為何首烏藥材的綜合質(zhì)量評價(jià)提供理論依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器
       CAMAG TLC scanner 3(瑞士卡瑪公司)；BS124S電子分析天平(德國Sartorius)；定量毛細管(Drummond USA)；DL-360A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。
1．2 試藥
       大黃素對照品(批號110756-200110，中國藥品生物制品檢定所)；大黃酸對照品(批號0757-200206，中國藥品生物制品檢定所)；大黃酚對照品(批號110796-200311，中國藥品生物制品檢定所)；大黃素甲醚對照品(批號110758-200307)，中國藥品生物制品檢定所)；2，3，5，4 -四羥基二苯乙烯-2， -D -D-葡萄糖苷對照品(批號1 10844-200404，中國藥品生物制品檢定所)；何首烏對照藥材(批號120934-200507，中國藥品生物制品檢定所)；硅膠G(青島海洋化工廠(chǎng))；其余試劑均為分析純。何首烏藥材，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院藥用植物與中藥鑒定教研室提供并鑒定(見(jiàn)表1)

2 方法與結果

2．1 溶液制備
        2．1．1 對照品溶液的制備：取2，3，5，4 -四羥基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷對照品4 mg，精密稱(chēng)定，置10 ml量瓶中，加稀乙醇適量，超聲3 min使溶解，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別取大黃素、大黃酚和大黃酸對照品各2 mg，大黃素甲醚對照品1 mg，精密稱(chēng)定，置2 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲5min使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密量取上述大黃素、大黃酚、大黃酸和大黃素甲醚對照品溶液各20 l，混合，作為對照品溶液I；另精密量取上述大黃素對照品溶液和2，3，5，4 -四羥基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷對照品溶液各10ul，混合，作為對照品溶液Ⅱ。
        2．1．2 供試品溶液與對照藥材溶液的制備：取本品粉末(過(guò)四號篩)和何首烏對照藥材粉末各0．2g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加入甲醇50 ml，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液蒸于，殘渣用甲醇溶解，定容至2mL量瓶中，搖勻，用0．45um濾膜濾過(guò)，即得。
2．2 薄層色譜條件
       薄層板：硅膠G(0．4％CMC-Na)，105℃活化1 h；點(diǎn)樣量：供試品溶液、對照品溶液I各5ul，對照品溶液Ⅱ10 uL；展開(kāi)系統：石油醚-乙酸乙酯一甲酸(15：5：1)為展開(kāi)劑I；三氯甲烷-甲醇-水[6．5：2．25：0．42，pH=4．0(以醋酸-醋酸鈉緩沖液調節)]為展開(kāi)劑Ⅱ；檢測方式：紫外燈下(365nm)成像。掃描條件：入_s=300 nm，入_R=370 nm。
2．3 方法學(xué)考察
       2．3．1 精密度試驗：取同一供試品溶液(何首烏對照藥材溶液)，在同一薄層板上連續點(diǎn)樣5次，測得兩個(gè)展開(kāi)系統中大黃素峰和2，3，5，4 -四羥基二苯乙烯-2-D-D-葡萄糖苷峰的峰面積，RSD分別為3．5％和2．7％，表明本法精密度良好。
       2．3．2 重復性試驗：取同一供試品5份(何首烏對照藥材)，按2．1．2項下方法制備供試品溶液，依法操作。測得兩個(gè)展開(kāi)系統中大黃素峰和2，3，5，4 -四羥基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷峰的峰面積，RSD分別為3．8％和4．9％ ，表明本法重復性良好。
       2．3．3 穩定性試驗：取同一供試品溶液(何首烏對照藥材溶液)，分別在0，6，12，24和48 h依法操作，測得兩個(gè)展開(kāi)系統中大黃素峰和2，3，5，4 -四羥基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷峰的峰面積，RSD分別為4．2％ 和3．3％ ，表明本品供試液較穩定。
2．4 實(shí)驗條件的考察
        2．4．1 提取方法的考察：1號德慶樣品分別用①甲醇，②乙醇，③三氯甲烷．甲醇(3：1)，④三氯甲烷，⑤乙醚超聲提取、濃縮，⑥ 甲醇超聲提取、蒸干、殘渣加水溶解、醋酸．醋酸鈉緩沖液(pH=4．0)調節使成酸性、加三氯甲烷提取、分取三氯甲烷層、濃縮、蒸于、殘渣用甲醇溶解。依法操作，結果表明①和③提取方法在不同展開(kāi)系統中斑點(diǎn)展開(kāi)清晰，分離效果較好，為簡(jiǎn)化操作，選擇① 甲醇作為提取溶劑。
        2．4．2 展開(kāi)系統的考察：甲醇為提取溶劑，分別比較①石油醚．乙酸乙酯．甲酸(15：5：1)，②環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(15：5：1)，③ 三氯甲烷．甲醇．水(7．5：2．5：0．2)，④三氯甲烷．甲醇一水[6．5：2．25：0．42，pH= 4．0(以醋酸一醋酸鈉緩沖液調節)]，⑤ 三氯甲烷-甲醇．水[6．5：2．25：0．42，pH：4．0(以醋酸-醋酸鈉緩沖液調節)，4℃展開(kāi)]，⑥苯一乙醇(2：1)／苯-乙醇(4：1)(中國藥典2005年版⋯)展開(kāi)系統的薄層色譜指紋圖譜。結果表明何首烏中蒽醌類(lèi)成分常用展開(kāi)劑①石油醚．乙酸乙酯．甲酸，斑點(diǎn)展開(kāi)清晰，分離效果好，作為展開(kāi)系統I；與中國藥典2005年版收載何首烏藥材鑒別方法⋯相比，在常溫下何首烏經(jīng)④三氯甲烷一甲醇一水[6．5：2．25：．0．42，pH=4．0(以醋酸-醋酸鈉緩沖液調節)]展開(kāi)后，斑點(diǎn)展開(kāi)較清晰，而且熒光條帶更多，信息量更為豐富，作為展開(kāi)系統Ⅱ。
2．5 薄層色譜指紋圖譜的建立
       依照上述實(shí)驗條件獲得的薄層色譜三維掃描圖譜。展開(kāi)系統I獲得的指紋圖譜中不同產(chǎn)地何首烏藥材具有一定的相似性，除去原點(diǎn)與前沿，共檢出4個(gè)共有峰。在展開(kāi)系統Ⅱ所獲薄層色譜三維掃描圖，跗值在0．1～0．8之間的10個(gè)共有峰構成了何首烏薄層色譜指紋圖譜基本骨架。由于多數峰沒(méi)有達到基線(xiàn)分離，且色譜峰寬窄不一，因此采用峰高值來(lái)表示各組分之間的相對含量。不同采集地何首烏藥材共有峰峰高柱狀圖，如圖1所示，不同產(chǎn)地各峰的高低不一。其中不同產(chǎn)地藥材均具有2，3，5，4 ．四羥基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷峰，而且含量變異較少(僅l0號田陽(yáng)樣品除外)，可作為何首烏鑒定的特征性成分，但是作為不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量評價(jià)沒(méi)有特征性意義。其它色譜峰構成的指紋特征，不同采集地的藥材質(zhì)量可以從其峰高得到反映，尤其是大黃素和大黃素甲醚所代表的特征峰。其中，通過(guò)峰高柱狀圖可以判定10田陽(yáng)樣品質(zhì)量與其它產(chǎn)地樣品差異較大，這與其含量測定的結果是一致的[5]。

3 討論

       3．1 葸醌類(lèi)、二苯乙烯苷類(lèi)和磷脂類(lèi)成分為何首烏的主要有效成分，該部位成分群體的一致性(包括成分種類(lèi)及其相對含量的一致性)能夠保證藥效的穩定。薄層色譜指紋圖譜建立過(guò)程中，磷脂類(lèi)成分以磷脂酸(L-α-phosphatidylethanolamine，PA)和磷脂酰膽堿(L-α-phosphatidylcholine，Pc)為對照品，三氯甲烷-甲醇-水為展開(kāi)劑，結果在與對照品相同Rf位置處并未觀(guān)察到相同顏色的熒光斑點(diǎn)。Nash 等人認為，三氯甲烷一甲醇．水三相不同濃度配比對分離磷脂類(lèi)成分有顯著(zhù)的影響，水在展開(kāi)劑中的含量對分離起很大作用。本研究中，增加上述展開(kāi)劑中水的用量，體積比從2％增加到0．46％ ，并用pH=4．0的緩沖液代替水，結果表明PA和Pc對照品溶液分離效果好，但未觀(guān)察到樣品中磷脂類(lèi)成分的熒光斑點(diǎn)，可能與方法的靈敏度低和磷脂類(lèi)成分不穩定等因素有關(guān)。因此本研究?jì)H以蒽醌和二苯乙烯苷類(lèi)成分綜合評價(jià)何首烏藥材的內在質(zhì)量。
       3．2 薄層色譜分析由于其快速、分析成本低、在同一薄層板上可同時(shí)平行分析多個(gè)樣品、可提供彩色圖像、形象直觀(guān)等優(yōu)點(diǎn)，應用于中藥色譜指紋圖譜分析時(shí)，通過(guò)穩定性、精密度及重復性考察，顯示本法適用于何首烏藥材內在質(zhì)量評價(jià)。

參考文獻

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[2]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì )．中國植物志．北京：科學(xué)出版社，1998，25(1)：102-103．
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[7]Nash A，Kraus Lj．Behavior of vegetable phospholipids in TLC optimization of mobile phase，detection and direct e．valuation．J．Chromatogr，1990，502：385．392．